转运反应成分的制备实验

1. 在一微量离心管中，4℃，10000 g 离心 APC 悬浮液 5~10 分钟，吸走上清。 2. 用 0.1 mol/L HEPES（pH 7.4），0.1 mol/L NaCl 重悬浮沉淀至浓度为 5 mg/ml。用这种缓冲液透析几次去除残留的硫酸铵。 3. 临用前用透析液溶解硫代 SMCC，浓度为 10 mg/ml。 4. 按 0.1 mg 硫代-SMCC/1 mg APC 的比例将

一、网状细胞和红细胞胞质液的制备 1. 自动物身上采血，每 7 ml 血加 1 ml 酸-柠檬酸盐-葡萄糖溶液（ACD；75 mmol/L 柠檬酸三钠，38 mmol/L 柠檬酸，136 mmol/L 葡萄糖，pH 5.0)。 2. 室温 500 g 离心 10 分钟收集网状细胞和红细胞。吸出血浆和白细胞层。 3. 用 1~2 倍体积的 2% 明胶（Sigma) /PBS溶液（预热至 37℃

1. 制备用于同透化的细胞 (1) 对于在盖玻片上生长的细胞 ① 将在标准条件下培养的细胞或从组织采集的原代细胞铺在置于 6 孔培养板中的 18x18 mmol/L 的盖玻片上，生长过夜。 ② 实验前 2~4 小时，换新培养液，重新放回培养箱中。 ③ 吸出培养基，用转运缓冲液清洗细胞两次。 ④ 将细胞转入含有转运缓冲液和 40~50 μg/ml 的毛地黄皂苷的 Coplin 缸或载玻片容

1. 将反应混合物加入一在冰上放置的微量离心管中。能量重建系统成分如下： 5 mmol/L 磷酸肌酸 20 单位/ml 肌酸磷酸激酶 0.5 mmol/L ATP 0.5 mmol/L GTP 2. 滴一滴孵育混合物到一片位于带盖子的湿盒中的封口膜上。将带有通透细胞的盖玻片上多余缓冲液吸去。倒置于孵育液滴上。对所有样品， 重复该步骤。对于悬浮培养细胞，可在一微量离心管中反应，细胞可以通过