蛋白质糖基化的检测实验

实验分类：

细胞实验

最新修订时间：2022-07-18

简介

本实验主要用于检测蛋白质的糖基化，是衡量蛋白质类药物的一项重要指标。

来源：丁香实验

操作方法

酶脱糖基化

一、用 PNGaseF（N-多糖酶）处理 1. 以 0.1 mol/L 磷酸钠（或 Tris-HCl，而不用柠檬酸）缓冲液，pH 7.4 ( 7.0~8.0 ) 配制高达 2 mg/ml 的蛋白溶液，并含 50 mmol/L β-巯基乙醇和 0.1% SDS，在水浴中煮沸 2 分钟。 2. 加 1/10 体积的 10% NP-40 溶液（或使 SDS 浓度少于或等于 0.17%，NP-40：S

化学脱糖基化

1. 在冰上预冷干净、干燥的玻璃器皿。用带有 Teflon-丝帽的玻璃试管混合试剂。 2. 打开或混合试剂前，在冰上预冷所有的溶液。从冰冷的原液中，TFMS:苯甲醚 ( Sigma) 以 2:1 (v/v) 的比例混合。缓慢的向试管内（放在冰上）注入一股氮气 10 秒钟，盖住试管倒转几次，然后用氮气重复处理。保持溶液在冰上。 3. 用冻干或真空离心法制备充分干燥的糖蛋白样品。 4. 当样品已

用生物素-亲和素复合物观察选择性标记糖蛋白

一、过碘酸钠氧化糖蛋白样品 1. 在 0.1 mol/L 醋酸钠 pH 4.5 缓冲液（50 mmol/L 磷酸钠，pH 7.4 ) 中制备蛋白溶液，在冰上预冷。 2. 用水制备新鲜的 0.5 mol/L 过碘酸钠原液，暗处保存，并在冰上预冷。 3. 加足够新鲜的过碘酸原液至蛋白样品中使成至 10 mmol/L ( 1 mmol/L )。 4. 在室温下避光保存 1 小时，或在 4℃ 保存

植物凝集素亲和层析

1. 在含有 Ca2+、Mg2+ 的 TBS 中平衡植物凝集素亲和介质，用至少 20 个柱体积清洗。 2. 在 5 ml —次性塑料吸管或注射器中制备 1 ml 植物凝集素柱。 3. 以缓慢流速（小于 0.25 ml/min）将蛋白样本上柱，回收所有过柱子的流过液。 4. 用 TBS 开始洗柱子，对于 1 ml 柱床体积的柱子，以 1 ml 1份收集流出液，共收集 10 个 1 ml 流分