酵母细胞中质粒的加工实验
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简介
利用一个假定的突变通过互补作用克隆酵母菌基因的一般方法。该突变为cdc101-1，它对酵母菌的生长来说既是隐性的又是温度敏感的。它使酵母可以很正常地在30°C生长，而不能在37°C形成菌落。如果用一个酵母菌基因组文库转化cdc101-1菌株，通过分离温度不敏感菌落，那么就可能分离到一个可以互补这种突变的酵母菌基因。分离到温度不敏感菌落后，必须采取两个步骤来证明在这种转化到cdc101-1菌株中的质粒含有野生型cdc101基因。第一步，假如这种观察到的互补现象是由质粒引起的，而非cdc101-1回复突变造成，互补质粒的分离必定导致质粒所带的选择标志及互补表型同时消失。第二步，必须排除是否被克隆的基因编码了这种突变的表型抑制基因的情形，而非野生型基因编码。这些均可通过互补实验来实现，并且可证明一个整合到基因组中的克隆基因的破坏是否能够互补原有的突变。来源：《精编分子生物学实验指南》第五版
来源：丁香实验
操作方法
1) 挑取几个含质粒的酵母菌单克隆，分别接种于10 mL非选择性培养基，30℃培养过夜。如果没有其他的选择，可以用YPD培养基，如果要保留其他不稳定遗传标志或质粒，可以用添加了与可能丢失的可选择标志相应的营养成分的确定成分培养基。2) 涂布在相应的非选择性平板上以得到单菌落，30℃培养2天。3) 影印到选择性平板上以确定丢失了质粒选择标志的菌落。将选择性平板和非选择性主平板置30℃培养过夜。
穿梭质粒1) 构建染色体上重要基因被破坏的单倍体菌株以及含有完整重要基因和URA3选择标 记的YEp或YCp质粒。2) 对于诱发突变，将重要基因亚克隆到带有不同选择标记的YCp载体上， 将大约10〜20μg DNA采用羟胺或其他技术进行诱变。或者将一个重要基因的突变衍生物克隆到YCp载体上。3) 用乙酸锂法将其转化入第1步中的菌株，利用添加了尿嘧啶的缺失成分平板选择 YCp质粒，在许可温度下进行培养（一般
定位突变质粒缺口修复技术和等位基因修复技术1）将目的基因亚克隆到带恰当的选择标记的YRp或YCp质粒上。2) 在基因内部的两个限制酶酶切位点上切割以产生缺口，在缺口的两侧各留下40〜200bP的同源区域，将得到的质粒片段进行凝胶纯化。缺口或切口尽可能靠近突变位点。3) 如果用于致突变，通过PCR制备所需的致突变片段。如果是用来拯救或定位染色体等位基因，进行步骤4。4) 将1μg带缺口的质粒DNA和PCR产生的片段共同转化入带适当标记的酵母
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