定位突变质粒缺口修复技术和等位基因修复技术

1）将目的基因亚克隆到带恰当的选择标记的YRp或YCp质粒上。

2) 在基因内部的两个限制酶酶切位点上切割以产生缺口，在缺口的两侧各留下40〜200bP的同源区域，将得到的质粒片段进行凝胶纯化。缺口或切口尽可能靠近突变

位点。

3) 如果用于致突变，通过PCR制备所需的致突变片段。如果是用来拯救或定位染色体等位基因，进行步骤4。

4) 将1μg带缺口的质粒DNA和PCR产生的片段共同转化入带适当标记的酵母菌中。 如果是用缺口修复来拯救基因组等位基因，就单独转化带缺口的质粒。

5) 将转化子接种在专用于质粒标记选择平板上，鉴别成功修复的结果。对于恢复或定位染色体等位基因，利用质粒分离技术鉴别选择标记不稳定的转化子。 如果突变正好位于缺口区域内，突变将会被修复的质粒携带。当突变位于缺口的附近时，其结果取决于交叉发生在什么部位。突变距离缺口区域越远，含有突变的质粒就会越少。

6) 如果以PCR为基础的突变作为突变发生的方案，筛选具有突变表型的转化子。