穿梭质粒

1) 构建染色体上重要基因被破坏的单倍体菌株以及含有完整重要基因和URA3选择标 记的YEp或YCp质粒。

2) 对于诱发突变，将重要基因亚克隆到带有不同选择标记的YCp载体上， 将大约10〜20μg DNA采用羟胺或其他技术进行诱变。或者将一个重要基因的突变衍生物克隆到YCp载体上。

3) 用乙酸锂法将其转化入第1步中的菌株，利用添加了尿嘧啶的缺失成分平板选择 YCp质粒，在许可温度下进行培养（一般为25℃)。在尿嘧啶存在的情况下，生长周期降低了对YEp质粒的选择性，也就是在每个转化菌落中，一部分细胞已丟失了（携带重要基因非突变拷贝的）质粒。但是应注意任何携带有来自于YCp质粒的未突变基因拷贝的转化子不能失去YEp载体。

4) 将每个转化平板都影印接种到两块含有5-FOA的平板上，同样保持对YCp的选择 性。将一块平板在许可温度下培养，另一块在非许可温度下培养（一般为36℃)。 作为对照，将每个转化平板都影印两个YPD平板并在相同的两个温度下培养。

5) 收集那些在许可温度下产生Ura—乳突而在非许可温度下不产生乳突的菌落（并在YPD培养基平板上在两种温度下都能正常生长），将它们划线接种以产生单菌落。

6) 对每一个候选菌株检验约6个菌落，看它们在两种温度下是否都能产生乳突。

7) 对于每一个在步骤6中已经检验过的温敏突变候选株，通过在保持YCp筛选的平板 上划线的方法，回收在许可温度下5-F0A平板上的Ura—乳突。从这些菌株（现在这些菌株应当只含有YCp质粒）分离质粒，将它们转化到大肠杆菌

8) 将带有温敏突变的基因亚克隆到YIP5质粒中，通过移换技术将这一突变基因引入染色体。