免疫胶体金技术

免疫学实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

胶体金作为免疫标记物始于 1971 年，Faulk 和 Taylor 将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。1974 年 Romano 将胶体金标记在马抗人 IgG 上，建立了间接免疫金染色法。1981 年 Danscher 确立了免疫金银染色法。层析法检测试剂最早出现于 1988 年，是 Unipath 公司利用染料颗粒开发生产的一种非常方便使用的妊娠检测试剂。1989 年，Spielberg 等发展了用于检测艾滋病毒抗体的渗滤法检测试剂，此后，免疫胶体金在快速检测试剂中得到了广泛的应用和发展。

目前，用于免疫胶体金快速检测实验的方法主要有 3 种：斑点免疫金染色法、斑点金免疫渗滤法和免疫胶体金层析技术法。

原理

免疫胶体金技术的基本原理是利用特异性抗原-抗体反应，通过带颜色的胶体金作为标记物使免疫反应结果显现出来，应用于抗原或抗体的定性、定位以及定量检测。

1. 氯金酸（HAuCL）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，金离子还原后聚合成一定大小的金颗粒，它由一个基础的晶核（11 个金原子形成的二十面体）和包围在外的双离子层构成（内层为负离子层 AuCl2，外层是带正电荷的 H＋）。由于静电作用，金颗粒之间相互排斥而悬浮成为一种稳定的胶体状态，故称胶体金。

2. 胶体金颗粒在弱碱环境下带负电荷，能够与带正电荷基团的蛋白质分子产生静电结合，使蛋白质吸附在金溶胶颗粒表面，形成稳定的胶体金标记的蛋白质。由于在标记过程中不需要经过任何化学方法交联，蛋白质如抗体的生物学特性可保持不变。

3. 胶体金还能够与 SPA、PHA、ConA 等生物大分子结合。用还原法可以方便地利用氯金酸制备各种不同粒径的胶体金颗粒，依直径大小颜色呈红色至紫色。

应用

免疫胶体金技术的常用应用领域如下：

（一）在电镜水平的应用

免疫金标记技术最先用于免疫电镜，直径为 3～15 nm 的胶体金均可用作电镜水平的标记物，免疫金染色（immunogoldstaining，IGS）已在电镜水平广泛应用。免疫金银染色（immunogold-silver staining，IGSS）是将 IGS 和银显影法相结合，结合于抗原部位的金颗粒还原银离子生成的银原子围绕金颗粒形成「银壳」，「银壳」本身具有催化作用，催化更多的银离子还原沉积并促使「银壳」不断增大，从而能加强细胞或组织抗原存在部位金属颗粒聚集的密度。金、银粒在电镜下显示高电子密度，呈黑褐色颗粒，外形清晰辨认度高，且不影响对原有超微结构观察，极大提高了电镜水平上的分辨率；其次，在电镜下可利用不同大小颗粒的胶体金标记进行免疫双重或多重标记，能在一张电镜图片上同时显示两种或多种被检测物质的组织或细胞的超微结构，进行抗原定性、定位以至定量研究。

（二）在光镜水平的应用

IGS 在光镜水平的应用较电镜晚。IGS 的特点是染色程序简便，无需显色步骤，就能够检测细胞表面和细胞内抗原，一般采用间接法。金颗粒直径应大于 20 nm，在光镜下可见金颗粒在金标抗体与相应抗原结合处聚集呈现砖红色。免疫金银染色（IGSS）法胶体金经过银显影增强后，光镜下，金颗粒因外周吸附大量银颗粒呈现黑色或黑褐色，从而放大了抗原存在部位，是迄今为止检测组织抗原最为敏感的免疫组化方法之一。

主要用于检测：

① 细胞悬液或培养的单层细胞膜表面抗原；

② 培养的单层细胞胞内抗原；

③ 组织中或半薄切片中抗原。

（三）在流式细胞术中的应用

通过流式细胞仪应用不同颜色的荧光素标记不同种类的单克隆抗体，可以在一个细胞上同时分析多种抗原分子，是免疫学研究中的重要技术之一。但由于在多色分析中，虽然可以通过荧光补偿消除荧光光谱重叠现象，但使用荧光探针越多，补偿的复杂程度随之增加。利用胶体金标记羊抗鼠 Ig 抗体，流式细胞术分析不同类型细胞表面抗原，胶体金标记的细胞在波长 632nm 时，90°散射角可放大 10 倍以上，同时对细胞无毒性。而且与荧光素共同标记，彼此互不干扰。因此胶体金可以作为多参数细胞分析和分选的有效非荧光素标记物，分析各类细胞表面标志和细胞内含物。

（四）在均相溶胶颗粒免疫测定（sol particleimmunoassay，SPIA）中的应用

利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致溶液颜色减退的原理，将胶体金标记抗体后，建立微量凝集实验检测相应的抗原，用肉眼可直接观察到凝集颗粒。SPIA 已成功地应用于 HCG 的检测，可直接应用分光光度计进行定量分析。

（五）在快速诊断中的应用

（1）免疫胶体金渗滤技术：基本原理是夹心法或间接法模式。

1）斑点免疫金染色法（dot immuno-gold staining，Dot-IGS/IGSS）：以间接法检测抗体为例，蛋白质抗原通过静电吸附在硝酸纤维膜上，随后加入的抗体通过与抗原特异性结合交联于纤维素膜上，然后再滴加胶体金标记的抗抗体，抗抗体和相应抗体的结合使抗原和抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法（Dot-IGS）。此反应可通过银显影液增强，即斑点金银染色法。

2）斑点金免疫渗滤法（dot immuno-gold filtration assay，DIGFA）：此法原理完全同斑点免疫金染色法，只是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。以间接法为例，在加抗原后，迅速加抗体，再加金标记抗抗体，由于有渗滤装置，抗原抗体反应快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。

（2）免疫胶体金层析技术：免疫层析法（immunochromatography）的基本原理是夹心法。

将抗原特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带（检测带），将干燥的玻璃纤维（含有冻干胶体金标记抗体）一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细作用，样品将沿着该膜向前移动，样品中的抗原与胶体金标记抗体形成免疫复合物，当移动至检测带时，形成胶体金标记抗体-抗原-抗体的双抗体夹心免疫复合物，因体积大于硝酸纤维素膜孔径而被截留、聚集在检测带，通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。而游离的胶体金标记抗体则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。因此，胶体金标记免疫层析技术作为一种新型的免疫学快速诊断技术，具有简单快速、特异灵敏、不需要特殊设备、检测结果较准确等特点，特别适用于野外作业及时间紧迫的检查和大面积普查。

来源：丁香实验团队

操作方法

免疫胶体金层析技术法检测妊娠

人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）是胎盘合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由和促卵泡素（follicle-stimulating hormone，FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）及促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）具有同源性的 α 亚基和 HCG 特异性 β 亚基组成