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酵母双杂交技术

实验分类:

蛋白质实验

别名:

yeast two-hybrid

最新修订时间:

简介

酵母双杂交系统(yeast two-hybrid)以酵母遗传分析为基础,研究反式作用因子之间相互作用对真核基因转录调控影响的实验系统。

其最有价值的应用是用BD-X筛选由AD-Y构成的cDNA文库,以获得新的蛋白质之间的相互作用,并分析研究新的基因。

本技术不仅可用于鉴定新的蛋白质相互作用,证实可疑的相互作用,确定相互作用的结构域,而且可直接获得编码相互作用的蛋白的基因。

原理

酵母双杂交(yeast two-hybrid)技术的的基本原理是:许多转录因子都包含两个相互独立的功能结构域,即DNA结合结构域(binding domain,BD)和转录活化结构域(activedomain,AD)。转录因子通过BD和AD分别与DNA上的特异序列结合,从而启动相应基因的转录。

酵母双杂交系统首先构建两种反式作用因子,将蛋白质X与报告基因转录因子特异的BD(如Gal4-BD,LexA-BD)融合,成为钓饵(bait);蛋白质Y与特异的AD(Gal4-AD,B42-AD)融合为猎物(prey)。

当编码两种结构域的基因在酵母细胞核内同时表达时,若蛋白X与Y之间存在非共价作用,就会使AD与BD两结构域的上游活化序列(upstream ac-tivation sequence,UAS)相互接近,进而激活转录过程,使报告基因(如HIS3、LEU和lacZ等)得到表达(图)。

BD与AD之间的连接(相互作用)能够有效地活化转录。由非共价键连接的两个结构域也可以通过蛋白之间的相互作用将BD和AD连接起来,从而启动转录;反之,也可以通过报告基因表达来评价结构域连接蛋白之间是否存在相互作用。

应用

酵母双杂交系统最有价值的应用是用BD-X筛选由AD-Y构成的cDNA文库,以获得新的蛋白质之间的相互作用,并分析研究新的基因。

本技术不仅可用于鉴定新的蛋白质相互作用,证实可疑的相互作用,确定相互作用的结构域,而且可直接获得编码相互作用的蛋白的基因。

来源:丁香实验团队

操作方法

酵母双杂交实验

酵母双杂交系统(yeast two-hybrid)以酵母遗传分析为基础,研究反式作用因子之间相互作用对真核基因转录调控影响的实验系统。其最有价值的应用是用 BD-X 筛选由 AD-Y 构成的 cDNA 文库,以获得新的蛋白质之间的相互作用,并分析研究新的基因。本技术不仅可用于鉴定新的蛋白质相互作用,证实可疑的相互作用,确定相互作用的结构域,而且可直接获得编码相互作用的蛋白的基因。

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