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固相 pH 梯度等电聚焦实验

实验分类:

蛋白质实验

最新修订时间:

简介

固相 pH 梯度等电聚焦(Immobilized pH gradients isoelectric focusing, IPGIEF)是 80 年代建立起来的一种新型等电聚焦技术。它利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时,在滴定终点附近形成 pH 梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合,从而形成固定的,不随环境电场等条件变化的 pH 梯度。本实验来源「蛋白质电泳实验技术」主编:郭尧君。

来源:丁香实验

操作方法

制胶

1. 选择 pH 范围,计算缓冲与滴定 Immobiline 的体积 对未知样品 pH 范围的选择,最好先用宽范围(如 pH 3.5~10 ) 载体两性电解质等电聚焦确定其等电点的位置,再选择窄范围的固相 pH 梯度等电聚焦。确定范围后,根据表 7.4 和 7.5 査得或进一步用内插法计算得到缓冲和滴定 Immobiline 的体积。 2. 贮液配置 丙烯酰胺单体贮液:溶解 14

等电聚焦

打开循环水浴,设置冷却温度,一般为 10℃。 将制好的固相 pH 梯度凝胶铺在冷却板上,注意正负极。其间涂以液体石蜡或煤油,避免气泡陷入,以保证胶板和冷却板之间的良好接触。 用合适的电极溶液(参见表 7.7) 润湿滤纸电极条,分别放置凝胶的酸、碱侧。有的仪器采用粗电极与凝胶直接接触,不需加电极条。 按冷却板上的格子和预先设计的实验计划将样品加在凝胶上。微量样品可直接滴加,稀样品加在滤纸块

pH 梯度的测定

由于固相 pH 梯度凝胶的导电性很低,不可能用表面电极测定凝胶表面的 pH。但对于宽范围的固相 pH 梯度可以用等电点蛋白标准来测定,方法同载体两性电解质等电聚焦。但目前还没有合适的市售蛋白标准可用于测定窄范围的固相 pH 梯度。灌制凝胶时,pH 梯度范围是已知的,且梯度是线性的。故可根据凝胶两端之间距离来测算 pH 梯度和蛋白质的 pI。在灌制非线性梯度胶时,则可根据非线性梯度来计算。

检测

1. 各种染色方法 在所述的染色方法,包括各种考马斯亮蓝方法、银染色、荧光探针法、放射自显影、免疫固定等均适用于固相 pH 梯度等电聚焦后的检测。 作者实验室进行转铁蛋白的考马斯亮蓝 R-250 染色时,脱色困难。用 G-250 染色时,脱色同样困难。为了提高脱色效率,改进了脱色液的配方,调整了染色和脱色时的温度和时间。 2. 凝胶干燥与保存 请参阅 “常规聚丙烯敢胺凝胶电泳”。 3.

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