原理
固相 pH 梯度凝胶是由固相 pH 梯度介质（丙烯酰胺衍生物）共价结合到聚丙烯酰胺凝胶中并形成 pH 梯度，所以制胶过程比载体两性电解质凝胶复杂。灌胶的方法与常规聚丙烯酰胺梯度凝胶和 SDS 梯度凝胶相似。高质量的凝胶介质和固相 pH 梯度介质，聚合过程以及漂洗对固相 pH 梯度凝胶是非常重要的。
材料与仪器
丙烯酰胺单体贮液 过硫酸铵贮液
灌胶模具
灌胶模具
步骤
1. 选择 pH 范围，计算缓冲与滴定 Immobiline 的体积
对未知样品 pH 范围的选择，最好先用宽范围（如 pH 3.5~10 ) 载体两性电解质等电聚焦确定其等电点的位置，再选择窄范围的固相 pH 梯度等电聚焦。确定范围后，根据表 7.4 和 7.5 査得或进一步用内插法计算得到缓冲和滴定 Immobiline 的体积。
2. 贮液配置
丙烯酰胺单体贮液：溶解 14.55 g 丙烯酰胺和 0.45 g N,N'-甲叉双丙烯酰胺在 35 ml 双蒸水中，搅拌直至溶解，用双蒸水加至 50 ml。过滤，溶液可在 4℃ 保存两周。
40% (W/V) 过硫酸铵贮液：溶解 0.4 g 过硫酸铵在 1 ml 双蒸水中。溶液必须新鲜配置。
Immobiline II：使用前将贮存在 4~8℃ 冰箱中的 Immobiline II 溶液在室温平衡约 0.5 小时。
3. 模具组装和凝胶溶液的配置
如 “水平平板电泳的制胶” 组装灌胶模具，但不需要在模具上做加样孔。如欲灌注 T=5%、C=3% 的凝胶，参见表 7.4，表 7.5 和表 7.6。凝胶溶液必须新鲜配置。一般将酸性 Immobiline 作为重液，碱性 Immobiline 作为轻液，俗称 “酸重碱轻”。如欲提高电泳速度，可加 100 μl 载体两性电解质。
4. 灌胶
固相 pH 梯度的灌胶模具可使用与常规聚丙烯酰胺梯度凝胶和 SDS 梯度凝胶灌胶相同的模具，参见 “水平平板电泳的制胶” 。但不需要做加样孔，并且不需要有浓缩胶和分离胶之别。作者实验室曾灌注 pH 4.4~5.4 固相 pH 梯度胶用于分析 Gc 蛋白亚型和 pH 5.05~5.60 固相 pH 梯度凝胶用于分析转铁蛋白。
(1) 灌胶前梯度混合器的腔间阀和流出管的夹子都应关闭。
(2) 将 7.5 ml ( 视凝胶大小而定）轻液（碱性）注入梯度混合器的储液腔。小心打开腔间阀，赶去腔间气泡，再关上腔间阀。若不慎有轻液流入混合腔，则需将轻液吸回储液腔。
(3) 将同样体积的重液（酸性）注入梯度混合器的混合腔。在两个腔中分别放入同样大小的搅拌子，在储液腔中放入补偿棒，此时两腔液面应该相平。
(4) 将梯度混合器置于磁力搅拌器的最佳位置上。将流出管插入灌胶模具中央。为了控制流速，得到线性梯度，梯度混合器的出口与流出管末端高度相差约 5 cm。开动磁力搅拌器（200~500 r/min)。
(5) 在两个腔中各自先加 TEMED，再加过硫酸铵。打开流出管的夹子，当酸液流到流出管的一半时，打开腔间阀。两腔中液面同时下降，在混合腔混合后，缓缓注入垂直放置的模具中。
(6) 灌注完毕后，在室温静置 5~20 分钟（可用异丙醇封胶 )。放入 30~40℃ 烘箱中聚合。灌胶后，立即洗净梯度混合器，以免堵塞腔间阀。
5. 洗胶和吹胶
凝胶聚合约需 1 小时，从烘箱中取出凝胶模具后，同 “薄层分析等电聚焦的方法” 方法取出凝胶，标上正、负极。称重后放入双蒸水中（6X10 分钟或 3X1 小时 )，室温下振摇约 60 次/分钟，洗去催化剂和未聚合的单体。洗胶后，用软纸吸去表面的水。用冷风（小电扇）在一定距离约（50 cm ) 吹胶至与洗胶前重量相差小于 1%。如果凝胶中含有过多水，影响胶浓度和梯度，在电泳时易在凝胶表面形成水滴，改变导电性干扰聚焦。小于 pH 8 的凝胶至多可保存一周，碱性胶不宜保存。
对未知样品 pH 范围的选择，最好先用宽范围（如 pH 3.5~10 ) 载体两性电解质等电聚焦确定其等电点的位置，再选择窄范围的固相 pH 梯度等电聚焦。确定范围后，根据表 7.4 和 7.5 査得或进一步用内插法计算得到缓冲和滴定 Immobiline 的体积。
2. 贮液配置
丙烯酰胺单体贮液：溶解 14.55 g 丙烯酰胺和 0.45 g N,N'-甲叉双丙烯酰胺在 35 ml 双蒸水中，搅拌直至溶解，用双蒸水加至 50 ml。过滤，溶液可在 4℃ 保存两周。
40% (W/V) 过硫酸铵贮液：溶解 0.4 g 过硫酸铵在 1 ml 双蒸水中。溶液必须新鲜配置。
Immobiline II：使用前将贮存在 4~8℃ 冰箱中的 Immobiline II 溶液在室温平衡约 0.5 小时。
3. 模具组装和凝胶溶液的配置
如 “水平平板电泳的制胶” 组装灌胶模具，但不需要在模具上做加样孔。如欲灌注 T=5%、C=3% 的凝胶，参见表 7.4，表 7.5 和表 7.6。凝胶溶液必须新鲜配置。一般将酸性 Immobiline 作为重液，碱性 Immobiline 作为轻液，俗称 “酸重碱轻”。如欲提高电泳速度，可加 100 μl 载体两性电解质。
4. 灌胶
固相 pH 梯度的灌胶模具可使用与常规聚丙烯酰胺梯度凝胶和 SDS 梯度凝胶灌胶相同的模具，参见 “水平平板电泳的制胶” 。但不需要做加样孔，并且不需要有浓缩胶和分离胶之别。作者实验室曾灌注 pH 4.4~5.4 固相 pH 梯度胶用于分析 Gc 蛋白亚型和 pH 5.05~5.60 固相 pH 梯度凝胶用于分析转铁蛋白。
(1) 灌胶前梯度混合器的腔间阀和流出管的夹子都应关闭。
(2) 将 7.5 ml ( 视凝胶大小而定）轻液（碱性）注入梯度混合器的储液腔。小心打开腔间阀，赶去腔间气泡，再关上腔间阀。若不慎有轻液流入混合腔，则需将轻液吸回储液腔。
(3) 将同样体积的重液（酸性）注入梯度混合器的混合腔。在两个腔中分别放入同样大小的搅拌子，在储液腔中放入补偿棒，此时两腔液面应该相平。
(4) 将梯度混合器置于磁力搅拌器的最佳位置上。将流出管插入灌胶模具中央。为了控制流速，得到线性梯度，梯度混合器的出口与流出管末端高度相差约 5 cm。开动磁力搅拌器（200~500 r/min)。
(5) 在两个腔中各自先加 TEMED，再加过硫酸铵。打开流出管的夹子，当酸液流到流出管的一半时，打开腔间阀。两腔中液面同时下降，在混合腔混合后，缓缓注入垂直放置的模具中。
(6) 灌注完毕后，在室温静置 5~20 分钟（可用异丙醇封胶 )。放入 30~40℃ 烘箱中聚合。灌胶后，立即洗净梯度混合器，以免堵塞腔间阀。
5. 洗胶和吹胶
凝胶聚合约需 1 小时，从烘箱中取出凝胶模具后，同 “薄层分析等电聚焦的方法” 方法取出凝胶，标上正、负极。称重后放入双蒸水中（6X10 分钟或 3X1 小时 )，室温下振摇约 60 次/分钟，洗去催化剂和未聚合的单体。洗胶后，用软纸吸去表面的水。用冷风（小电扇）在一定距离约（50 cm ) 吹胶至与洗胶前重量相差小于 1%。如果凝胶中含有过多水，影响胶浓度和梯度，在电泳时易在凝胶表面形成水滴，改变导电性干扰聚焦。小于 pH 8 的凝胶至多可保存一周，碱性胶不宜保存。
来源：丁香实验
