多重 PCR

多重 PCR 基本原理与常规 PCR 相同，区别是在同一个反应体系中加入一对以上的引物，如存在与各对引物互补的模板，则它们分别结合在模板相对应的部位，同时在同一反应体系中扩 增出一条以上的目的 DNA 片段。多重 PCR 反应体系的组成和 PCR 循环的条件需要经过优化以 确保同时扩增几个片段"理论上只要 PCR 扩增的条件合适，引物对的数量可以不限，但由于各 种条件的限制，实际能够扩增的引物对数量是有限的。
PCR 结果的分析方法有以下几种，包括：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸杂 交、限制性酶切分析、核酸测序等，其中琼脂糖凝胶电泳是最简单、最快速的方法，但是与聚丙 烯酰胺凝胶电泳相比分辨率比较低。限制性酶切分析需要将 PCR 产物回收酶切后再次电泳，耗 时费力，难以推广应用以核酸测序是鉴定 PCR 产物最可靠的方法，但需要专门的测序仪器，并 且需要花费的时间也比较长。如果要将鉴定感染性疾病病原的多重 PCR 方法用于临床及现场流 行病学调査，琼脂糖凝胶电泳是最佳的选择。

多重 PCR 的常用应用领域如下：

（一）多重 PCR 在遗传病诊断方面的应用

1.DMD 和 BMD 的检测

Duchenne 型肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是一种很常见的人类遗传 病，为 X 性染色体隐性遗传性肌肉变性疾病，50% 的病例由基因缺失引起，大约每 3500 个男婴 就有一个发病，1/3 的病例由新的突变所致。肌营养不良基因长 2000kb, 至少有 70 个外显 子，被 35 个平均 35kb 的内含子所间隔。目前尚无有效治疗的方法，因而高度准确的产前诊断和 DMD 阳性筛选是十分重要的。以往多用 Southern 分析技术来诊断，但由于该基因由多达 70 个外显子，至少需要 7〜9 个 cDNA 克隆才能诊断，费用高、费时而难以常规开展。BMD 是 Becker 型肌营养不良症（Becker muscular dystrophy）的缩写。BMD 亦为 X 性染色体隐形遗传性 肌肉变性疾病。BMD 的发病率为新生男婴的三万分之一。65% 的 BMD 病例的原因是基因 缺失。
Chamberlain 等利用多重 PCR 技术对 DMD 进行了检测，设计了 6 对外显子引物。用 1μmol/L 引物加 10U Taq 酶，延伸温度为 72C 3 min, 25 个循环。产物电泳后，如与正常对照的 对应条带相比有缺失或移位，即为异常。随后该实验室又将引物增加至 9 对，使至少 80% 的 DMD 基因缺失得到确定，能直接诊断 50% 以上的病例。Hentemann 等设计了 2 对产物分别为 140bp 和 73bp 的引物，对 42 例病人检测后，发现 7 例基因缺失并经 Southern 杂交分析证实。Simard 等如报道用 Chamberlain 的引物对 DMD 进行扩增，并对 DNA 模板处理进行了改进，用 1 ml 羊膜液离心后的细胞经非离子去垢剂和蛋白酶 K 的 PCR 缓冲液裂解后直接 PCR 扩增，效果 令人满意。由于 DMD/BMD 是等位基因，近来的文献多同时检测此两种疾病。Beggs 等用多 重 PCR 同时检测肌营养不良基因的 8 个外显子和启动子，可使 98% 有基因缺失的 DMD/BMD 获 得诊断。Covone 等人用两种方法对照研究了 127 例 DMD/BMD： 一种方法是用与 DMD cDNA 相关的 9 种 cDNA 探针与 HindJH 消化的基因族 DNA 杂交，另一种方法是用 9 对 DMD 外显子的 引物进行多重 PCR 检测，结果 73 例（57%）存在基因缺失，两组方法结果相近。我国华西医科 大学的学者亦用 Chamberlain 的 9 对引物对 17 例 DMD/BMD 病例进行了检测，结果 8 例（47%）发现基因缺失，证明了针对西方人的引物序列同样可以检测中国病例。

2. 用于其它遗传病的检测

Picci 等人已对囊性纤维化 (cystic fibrosis, CF) 基因突变进行了筛选研究，用 4 对外显子 引物进行多重 PCR 扩增，然后用限制性内切酶消化 PCR 产物，再进行垂直聚丙烯酰胺凝胶电 泳, 检査 15 例发现有 3 例发生了基因突变。Prior 等设计了 8 对引物同时检测 DMD/BMD 和 CF, 通过凝胶电泳筛选 DMD/BMD 缺失突变，并用等位基因特异的寡核甘酸杂交确定 CF 突变 是否存在。实验表明，可以通过多重 PCR 的方法从血斑中获得足够的 DNA 进行分子分析，可用 于新生儿的筛选。Pillers 等人用多重 PCR 和 Southern 杂交方法研究了一位同时患 AIED (Aland island eye disease) 甘油激酶缺乏 (GKD) 和 DMD 的病例，发现在 DXS67 (l-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase 67) 和 DMD 基因之间出现基因缺失。另外，还有用多重 PCR 方法筛 査类固醇硫酯酶 (steroid sulfatase, STS) 缺乏症和诊断日地中海贫血患者的报道。
脊髓性肌萎缩症 (spinal muscular atrophy, SMA) 是一种常染色体隐性遗传神经性肌肉疾 病。SMA 会造成位于脑底和脊髓的下级运动神经元分裂，从而使其无法发出肌肉进行正常活动 所依赖的化学及电信号。SMA 主要影响患者的近端肌，即最靠近人体躯干部的肌肉。控制胃、 肠和膀胱等器官运动的非随意肌不会受到影响。各型都会对控制随意肌运动的叫作运动神经元的 神经细胞产生影响。最近的基因研究发现，运动神经元的死亡也许是因为缺少一种或几种蛋白， 或者是它们不能完全发挥其功能而导致的。Simard 等网应用多重实时反转录 PCR 方法 (multiplex real-time reverse transcriptase-PCR) 对存活运动神经元 (survival motor neuron, SMN) 的 转录本进行定量，共检测了 42 个潜伏期 SMA 病人的血标本，每个病人取三个时间点，发现 SMN 的表达在每个病人的不同时间点上的转录是稳定的，SMN mRNA 表达的实时定量检测可 以作为 SMA 临床试验的生物标志。
甘露糖结合素 (m&nnosobinding lectin, MBL) 是一种血清蛋白，能够触发补体激活，因此 在先天性免疫中发挥重要作用。低水平的 MBL 会损伤病原微生物的调理作用，进而导致儿童的 反复感染、免疫受损病人的严重感染以及自身免疫疾病。MBL 的编码基因位于人类 10q11.2〜q21 染色体，包括四个外显子，血清中 MBL 水平受其启动子多态性和基因第一 个外显子突变的影响。目前应用的 MBL 基因分型方法主要有以下几种：PCR-限制酶切分析、序 列特异寡核昔酸探针杂交 (sequence_specific oligonucleotide probes, SSOP)、放大受阻突变体系 (amplification refractory mutation system, ARMS)、ARMS 联合 SSOP、异源双链分析 (hetero duplex analysis)。实时 PCR 以及应用小沟结合 DNA 探针的 5』端核酸酶分析。Helena 等建立了 一种快速、高效的多重 PCR 方法对 MBL2 基因进行分型，并且将捷克人作为斯拉夫人的代表样 本，应用此方法研究了 MBL2 的等位基因频率。共分析了 359 个不相关捷克人的 MBL2 基因， 最终得出 LYD 单元型在斯拉夫人的祖先中比其它高加索人更常见，同时也证明了多重 PCR 是一 种比传统 PCR 方法更快速、简便、省时省力的 MBL2 分型方法。
根据当前不育领域的研究，大约 10％〜15% 的夫妇存在不育的问题，而在所有的不育个体 中，男性不育大约占 50%, 其中 40%〜50% 存在精子缺陷，如少精症和无精症。 人类 Y 染 色体的长臂对于精子的产生是必需的。在三个不同区域的缺失会导致严重的精子缺陷，包括非闭 塞的无精子症和精子减少症。这些区域被称为无精子症因子 (azoospermia factor, AZF)，三个 分离的非重叠区被定义为 AZFa、AZFb、AZFc, 与产生人类损伤的精子有关。近来的研究证明 Yq 染色体的微缺失会遗传给其儿子。Yeom 等应用多重 PCR 扩增 6 个位点，包括 Y 染色体 的性别决定区 (sex-determining region on the Y chromosome, SRY) 作为阳性对照，无精子症因 子区域的 5 个序列标签位点 (sequenc-tagged site, STS), 其中模板是从不育男性血液中提取的 基因组 DNA。本研究中的引物为 Cy3 标记，PCR 产物可以与固定的探针杂交，提供了一种敏 感、高通量检测 Y 染色体缺失的方法，也是一种男性不育筛选的新方法。

(二) 着床前胚胎遗传学诊断 (preimplantation genetic diagnosis, PGD)

PGD 产生于 10 多年前，主要目的是识别基因突变或染色体错误引起的遗传性疾病。临床上 最早是用来检测夫妻 X 隐形连锁疾病，随后应用于不同的患者来达到优生优育的目的，主要包单基因病携带者，无论显性或隐性、常染色体或 X 连锁；染色体结构异常携带者，包括易 位、翻转、缺失、插入等；避免高龄产妇后代染色体异常；辅助生殖治疗反复植入失败的夫妇； 反复出现不明原因流产的夫妇。当前 PGD 已经成为产前诊断 (prenatal diagnosis) 的一种替代 方法。

对于单基因缺陷患者，可以用多重 PCR 同时扩增多个位点，选择那些位于相同染色体或者 临近致病基因的多态性标志位点进行扩增能够有效诊断突变位点和多态性等位基因，可以同 时分析多个诊断位点，并且减少错误诊断的概率。另外，还可以扩增高变的指纹位点，指示 DNA 模板是否被污染。
囊性纤维化病 (cystic fibrosis, CF) 是一种首次成功应用单细胞植入前基因诊断的单基因缺 陷性疾病。CF 的突变谱差别很大，因此，发展一种突变特异的 PGD 方法是行不通的。文献建立了一种针对 CF 通用的多重 PCR 方法，用于胚胎的遗传学诊断。本研究应用了 CF 跨膜调控子 (cystic fibrosis transmembrane regulator, CFTR) 两侧的 4 个紧密连锁高多态性重复标识：D7S523、D7S486, D7S480 和 D7S490。共检测了 100 个白细胞和 50 个卵裂球，其中 99% 获得了多重 PCR 结果，总体等位基因遗失 (allelic drop out , ADO) 频率从 2%〜5% 不等。确认 ADO 以及额外等位基因存在后，95% 的多重 PCR 结果可以用来建立基因型标记。基于父母的基 因型，考虑到由于变异参数 (5%)、ADO (0〜2%) 和单重组 (1.1%〜3%) 造成的胚胎传送 丢失，大约 90% 的胚胎能够应用单个卵裂球进行可靠的 PGD 基因分型。错误诊断的概率与已知 的两侧标识双重组概率相当，小于 0.05%。因此，这种多态性和多等位基因标识系统是一种可 靠的、可替代直接突变胚胎遗传学诊断的方法。

(三) 在遗传修饰生物 (genetically modified organisms, GMO) 中的应用

近年来可见应用多重 PCR 技术在转基因成分定性和定量检测的报道。陈文炳等用多重 PCR 方法在反应体系中加入 13 对引物同时检测转基因矮牵牛与阳性对照质粒中的 1〜3 个外源基 因，包括花椰菜花叶病毒 (cauliflower mosaic virus, CaMV) 35S 启动子、根瘤农杆菌胭脂碱合 成酶基因终止子 (NOS)、大肠杆菌 K12 菌株新霉素磷酸转移酶 U (NptH) 编码基因。结果表 明，多重 PCR 不但可以提高检测效率、降低检测成本，还可以有效防止假阳性结果的出现。

(四) 基因重排

免疫球蛋白 (immunoglobulin, Ig) 和 T 细胞受体 (T cell recetptor, TCR) 位点包含很多不 同的 V、D、J 基因片段，参与早期白细胞分化的重排过程。V-D-J 片段重排由重组酶复合体介 导，其中 RAG1 和 RAG2 蛋白通过识别、切割 DNA 重组信号序列 (recombination signal sequences, RSS) 发挥重要作用，RSS 位于 V 基因下游、D 基因两端和 J 基因上游。不合适的 RSS 会降低甚至完全阻止重排。van Dongen 等成功建立了一种多重 PCR 方法并将其标准化，能够 检测同源细胞重排免疫球蛋白和 T 细胞受体基因、染色体畸变 t (11； 14) 和 t (14； 18)。在 18 个多重 PCR 反应中，可以使用 107 对不同的引物进行扩增。14 个 Ig/TCR 和 4 个 BCL1/BCL2 多 重反应体系证明了多重 PCR 反应完全适合淋巴增生缺陷的克隆研究，并且具有较高的敏感性。 特别是在疑似 B 细胞增殖中与 IGH 和 IGK 联合应用，疑似 T 细胞增殖中与 TCRB 和 TCRG 联合 应用具有极高的克隆检出率。

(五) 抗性基因检测

抗生素的广泛使用导致具有耐药性微生物的增多，比如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methi- cillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 万古霉素抗性肠球菌 (vancomycin resistant en - terococci) 和多重耐药结核分枝杆菌 (multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis) 等。这些 病原的快速检测及对应的抗生素抗性快速检测对于隔离病人和阻止疾病的进一步蔓延是很重要 的。多重 PCR 方法能够对这些抗生素抗性基因进行同时检测，节省时间，具有较高的敏感性和 特异性。

Strommenger 等应用多重 PCR 方法同时检测金黄色葡萄球菌的 9 种耐药基因，包括 mecAy aacA〜aphD、tetK、tetM、ermA、ermC、vatA、vatB 和 vatC， 并且在反应中加入另外 一对引物，扩增金黄色葡萄球菌的 16S rRNA 作为阳性对照。通过对分离的 30 株金黄色葡萄球 菌进行检测，多重 PCR 结果与肉汤微量稀释实验得到的抗性表型一致，证明了多重 PCR 是一种 识别抗生素抗性的快速、简便、精确方法，并且可以用于临床诊断、流行病学研究中用于监测抗 性基因的传播。

还可用多重 PCR 方法同时检测质粒介导的喳诺酮抗性基因 qnrA、qnrB 和 qnrS，并用来筛 选科威特分离的 64 株产超广谱步内酰胺酶 (expanded-spectrum beta-lactamase, ESBL) 的肠细菌。

(六) 微生物检测

多重 PCR 作为一种分子检测、分型方法基本上可以用于所有的微生物，但只有用于检测难 培养或不可培养微生物方面才能充分发挥其优势。
多重 PCR 可以根据需要选择不同的引物，扩增不同的目的片段。而这些扩增模板组合的选 择一般遵循以下原则：同一微生物的不同基因 (以减少假阳性结果的出现)；同属不同种的微生 物，主要用于微生物的分子分型；混合的微生物，包括一些引起相同或相似症状的微生物，拥有 相同生活环境的微生物，还有一些人为放在一起的微生物，如战伤细菌组合。

1. 检测一种微生物 (检测毒力相关基因)

金黄色葡萄球菌主要产生肠毒素 (staphylococcal enterotoxins, SE)、毒素休克症毒素 (toxic shock syndrome toxin, TSST)、脱落毒素 (exfoliative toxins) A 和瓦 Lovseth 等见用多重 PCR 方法检测金黄色葡萄球菌的 9 个肠毒素基因一 sae, seb, sec, sdl, see, seg, seh, sei 和 sej， 以及毒素休克综合征毒素 (toxic shock syndrome toxin, TSST)、16sRNA 基因，通过对多重 PCR 进行优化，能够对 9 种毒素进行正确区分。

猪链球菌是一种能引起小猪脑膜炎、关节炎、心囊炎、肺炎的病原体，多发于 3〜12 周猪 龄，特别是刚断奶的幼猪。猪链球菌在全世界范围内广泛分布，并且造成猪肉产量的损失。由于 缺乏有效的疫苗和敏感的诊断方法，猪链球菌感染一直很难得到控制。迄今为止，根据荚膜抗原 的不同，共发现 35 个血清型，其中 1/2、1、2、7、9 和 14 最为常见。然而，扁桃体可以被非产 毒猪链球菌和其它链球菌感染，仅仅依靠菌落形态很难进行区分。为了弥补这一缺陷，发展了选 择性培养基的血清型特异分离技术和免疫磁珠技术。然而，迄今为止只应用于血清型 2 和血清型 1/2 的分型。另外，这些方法费时费力，并且敏感性低。PCR 方法可以方便、特异地对猪链球菌 的毒力相关表型和特异血清型进行区分，而在此基础上的多重 PCR 方法更减少了 PCR 反应的数 量。Wisselink 等建立了两个多重 PCR 反应体系，可以用 96 孔板进行操作，能够对猪扁桃腺 标本中猪链球菌的 6 种主要血清型和两种毒力相关表型进行检测。
Guo X 等应用多重 PCR 方法从临床分离的菌株中检测肠出血性大肠杆菌 (enterohemor- rhagic escherichia coli, EHEC) O157 : H7 的毒素相关基因，包括志贺样毒素基因 (shiga-like toxin, sit)slt1 和 slt2、eaeA 和溶血素 (hly) 基因，共检测了 85 株 O157 : H7, 毒力基因检出 率为 56. 5% (48/85), 其中 79.2% (38/48) 含有 slt2、eaeA 和溶血素 (hly)，16.6% (8/48) 携带所有 4 种基因，4.2% (2/48) 只有 slt2 和 hly 基因。与国外文献报道不同，slt1 具有较低的携带率。本 研究表明多重 PCR 可以作为一种简单、快速、特异、敏感的毒力基因检测方法。

2. 对微生物进行分型

（1）同种微生物分型： 由于微生物在种水平以下还有亚种、株的分类，虽然各型细菌之间有 区别，但仅仅从表型上并不能进行区分，这就给临床诊断带来了挑战。而多重 PCR 方法作为一 种能直接针对病原基因进行分型的方法，得到了广泛的应用。

Fujioka 等建立了两个多重 PCR 反应，用来检测五类致腹泻大肠杆菌 (diarrheagenic Escherichia coli, DEC) 的 9 个毒力相关靶标基因。反应 1 包括 5 对引物：stxl、eaeA、invE, STp 和 astA；反应 2 包括 4 对引物：stx2、aggR. STh 和 LT。两个多重 PCR 反应在识别相关 菌株方面无非特异条带，显示了 100% 的特异性，从 683 株疑似大肠杆菌中检测到 51 株 DEC 和 38 株 astA 阳性菌. 本研究证明了这些方法能够降低多重 PCR 反应试剂的费用，而且对临床实验室诊断 DEC 有贡献。

（2）鉴定同属不同种的微生物：应用种特异性引物进行扩增可以对不同种的微生物进行分型。通常选择毒力基因、降解基因、酶基因等某种菌持有的基因。

Alvarez 等建立了对沙门菌进行检测和流行病学分型的多重 PCR 方法，共涉及了 6 对引物 用来检测西班牙地区沙门菌的主要血清型和噬菌体型，另外还有一对引物用来作为内部阳性对照。将此方法用于临床粪便标本检测时，主要血清型 Enteritidis 和鼠伤寒的检测敏感性为 93%, 特异性为 100%, 有效率为 98%。PCR 反应的抑制率较低，为 8%。cohen’s kappa 指数显示，多重 PCR 与传统培养依赖的方法进行沙门菌分型的吻合率为 95%。Sharma 等建立了一种多重 PCR 方法用来检测金黄色葡萄球菌的毒素基因，将毒素基因的通用引物和毒素特异引物联合使 用，结合新的 DNA 纯化方法，可以在 3~4 h 内从纯培养物中检测肠毒素基因 A~E。用于检测 多重环境中金黄色葡糖球菌分离物，结果显示多重 PCR 方法与标准的免疫学分型方法吻合度达 99%, 并且本方法不仅可以扩增已知的毒素基因，还能用来检测具有新特点以及未知的毒素基 因。Panicker 等应用多重 PCR 检测沿岸水和贝类中的致病性弧菌，选用的基因包括：脆弱弧 菌的 vvh 和 viuB , 霍乱弧菌的 ompU、toxR 和 hlyA , 副溶血弧菌的 tlh、tdh、trh 和开放阅读框 8, 通过扩增这些基因能够确定全部致病菌株，并且可以对这三种弧菌进行分型。

（3）鉴定混合的微生物： 多重 PCR 可以在一次反应中鉴定引起相同临床症状或感染同种组 织或器官的微生物。由于不同病原微生物可以引起相同或相似的临床症状，仅仅靠临床表现难以 进行区分和鉴定。有些时候，能够通过同一传播途径进行感染的病原也需要进行同时检测，如食 源性、水源性、通过海产品传播的病原等。

①引起神经系统症状的：神经系统感染对于临床医生和微生物学家来说都是一个很难的诊 断难题。疱疹病毒感染可以导致多种临床症状，包括脑炎、脊髓炎、脑膜炎等。Bouquillon 等建立的多重 PCR 方法可以同时检测 6 种人疱疹病毒：单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）1 型、2 型，人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）, 水痘带状疱疹病毒（varicella-zoster virus, VZV）, 非洲淋巴细胞瘤病毒（epstein-barr 病毒，EBV）, 人类疱疹病毒 6 型（human herpes virus 6）, 说明多重 PCR 是一种快速可靠的疱疹病毒感染诊断方法。Markoulatos 等建立的多重 PCR 方法可以同时检测 HSV-K HSV-2、VZV、CMV 和 EBV 等。共检测了 86 份脑脊液标本，共检测到 9 份阳性，占总标本的 10.3%, 其中 HSV-1 有 3 份，占 3.5%； VZV4 份，占 4.6%； HSC-11 份，占 1.16%； CMV1 份，占 1.16%；未检测到 EBV 阳性标本。同时检 测 5 种不同疱疹病毒的多重 PCR 方法提供了一种早期、快速、可靠的非侵入性诊断工具，用于 指导特异性的抗病毒治疗，说明多重 PCR 方法具有重要的临床价值。Casas 等如应用多重反转 录 PCR 检测了 200 例神经症状被怀疑感染了病毒的住院病人（其中具有正常免疫力的病人 156 人，免疫缺陷病人 44 人）。在 156 例免疫力正常的病人中，肠道病毒和嗜神经疱疹病毒的阳性率 为 35%（55 例），代表了无菌性脑膜炎或脑炎；在 44 例免疫缺陷病人中，阳性率为 41%（18 例），主要病原为嗜神经疱疹病毒。多重反转录 PCR 的应用广泛，并可能成为一种特别有价值的 快速、敏感的神经性疾病诊断方法。

②引起腹泻症状的： 能够导致腹泻的病原菌主要为食源性，所以检测腹泻病原的标本主要 分为两种：食物标本和粪便标本。传统的检测方法包括分离培养、生化鉴定，费时费力，需要 4〜7d 才能得到结果。

Brasher 等建立的多重 PCR 可以检测贝类中的大肠杆菌，以及鼠伤寒沙门菌、脆弱弧菌、 霍乱弧菌和副溶血弧菌，其选取的特异基因分别为 uidA、cth、invA、ctx 和 tl 基因。其中大肠 杆菌可以指示标本被粪便污染的程度，其它四种为贝类中的常见病原，优化后的多重 PCR 方法 敏感性低于 101〜102cfu, 是一种有效、敏感、快速检测贝类中微生物病原的方法。Kim JS 等分别选取了大肠杆菌 O157 ： H7、沙门菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌和副溶血弧菌的 特异基因志贺样毒素（细胞毒素 II 型）、femA（胞质蛋白）、toxR（跨膜 DNA 结合蛋白）、iap（侵袭相关蛋白）和 invA（侵袭蛋白 A）, 实验证明这 5 种引物的特异性良好，而且能够在 24 h 内 得到检测结果。

③引起呼吸道症状的：呼吸道病毒感染诊断的传统方法是细胞培养和直接荧光抗体 (direct fluorescent antibody, DFA) 实验。多重反转录 PCR 是一种检测病毒的敏感、特异、快速方法。 Syrmis 等建立的多重反转录 PCR (m-RT-PCR) 方法用多个针对病毒的特异引物，与针对病 毒特异基因序列的酶联扩增杂交试验 (enzyme-linked amplicon hybridization assay, ELAHA) 结 合，检测了 598 份疑似呼吸道感染者鼻咽抽吸物 (nasopharyngeal aspirate, NPA) 标本，方法的 特异性为 100%。与 m-RT-PCR-ELAHA 方法相比，DFA 的敏感性为 79.7%, 培养物扩增 DFA (culture amplified-DFA, CA-DFA) 为 88.6%。用 m-RT-PCR-ELAHA 方法筛选的 598 份 NPA 样 本中，3% 为腺病毒 (adenovirus, ADV) 阳性，2% 为流感病毒 A (influenza A),0.3% 为流感 病毒 B (influenza B) , 1% 为副流感病毒 1 型 (parainfluenza type 1, PIV1) , 1% 为副流感病毒 2 型 (parainfluenza type 2, PIV2) , 5. 5% 为副流感病毒 3 型 (parainfluenza type 3, PIV3) , 21% 为 呼吸道合胞病毒 (respiratory syncyial virus, RSV) 。 与 DFA 和 CA-DFA 方法相比，m-RT-PCR- ELAHA 具有敏感、特异、快速的优点，是对临床实验室检测呼吸道病毒传统方法的重大改进， 是一种可以用于日常临床和实验室操作的方法。
Bellau-Pujol 等建立了三个多重反转录 PCR, 用来同时检测 12 种 RNA 呼吸道病毒，包括 流感病毒 A、B、C, 人类 RSV, 人变性肺病毒 (human metapneumovims, hMPV), PIV-1 2、 3、4, 人冠状病毒 OC43 和 229E, 以及鼻病毒 (rhinovirus, hRV)。与免疫荧光和病毒分离方法 相比，多重 PCR 更为敏感、快速，能够检测更多种类的呼吸道病毒。
多重 PCR 可以与其它方法结合，拓宽了其应用范围。将多重 PCR 与实时定量 PCR 结合打破 了传统的科学术语，多重实时定量 PCR (multiplex real-time PCR) 通常用于描述应用多个寡核苷酸探针区分多个扩增子的情况。由于可获得的荧光基团种类有限，导致这种方法的应用是有一 定难度的。RT-PCR 是用来扩增 RNA 的方法，与多重 PCR 结合的多重反转录 PCR 也用于扩增 RNA, 主要用于同时检测 RNA 病毒。Diaz de Arce 等建立了新的、敏感性高、特异性好的多 重反转录 PCR, 用来对古典猪瘟以及其它猪瘟病毒感染进行同时检测和分型，设计的引物针对 扩增 5'端非编码区和 NS5B 基因。