请问多重PCR的体系如何优化？

在选择多重PCR扩增条件(尤其是退火温度和时间)时应尽量选择有利于较大片段扩增的条件

(1)退火时间和温度在循环参数中,影响多重PCR扩增效率的主要因素是复性温度和延伸时间。复性温度的设置策略与单个PCR相似。先计算引物的熔解温度(Tm),在此基础上推算复性温度T。(T=T。-5)。然后用“逐步引人法”确定多重PCR的最佳T,即每增加一对引物,就根据扩增的结果调整复性温度,直至每一种被扩增的基因片段都获得满意的效果。延伸时间是影响扩增产量的重要因素。随着扩增的基因座数目的增加,延伸时间也应延长。在最佳的Mg2+和dNTP浓度范围内通过延长延伸时间来提高扩增产量,比单纯增加Mg2+和dNTP浓度更为有效。 退火时间对扩增效率的影响远远小于退火温度的影响,将退火温度降低4~6℃对于在多重PCR中扩增出同样的基因是必需的。多重反应中并发的其它基因的特异扩增会消除非特异扩增的影响,同样,扩增效率高的基因会使扩增效率低的基因的扩增产量降低 。

(2)延伸温度高的延伸温度会减少某些基因的扩增,即使用长的退火时间和延伸时间也可能无法消除这种影响。

(3)延伸时间在多重PCR中,由于同时扩增多个基因,酶和dNTP的缺乏就成为限制因素,就需要更多的时间来完成所有产物的合成。多重PCR中增加延伸时间,可以增加较长PCR产物的量。也有实验表明,当延伸时间延长时,所有基因的PCR产物量都增加了 4)PCR循环数PCR产物量增加最明显的是在25个循环附近。通常对于一个反应,2830个循环就足够了,增加至60个循环对产物量无明显影响 总之,多重PCR反应条件的设置是一个棘手的问题,也是多重PCR成功的保证。一般策略是首先进行单个PCR反应,分别设定各引物对应的条件;然后,依次增加引物对,不断调整反应条件直至最后保证所有的引物对都能在同一条件下扩增出目的条带。

优化引物

多实验中要求加入的多对引物既不能互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合。另外传统实验中，为了使结果便于凝胶检测，还需设计不同扩增子片段大小不一。多重PCR中的不同扩增片段还会互相竞争资源，其结果是高丰度模板能够被很容易的检测到，而低丰度的模板彻底沦为背景。因而引物设计除了遵循一般的规则之外，还需要注意以下几点：

a. 引物特异性：

各引物与其它扩增片段不能存在较大的互补性，扩增片段之间也不能有较大同源性；

b. 引物长度：

一般18-24碱基，各引物之间不能互补，尤其避免3’端互补。较长的引物更易形成二聚体；

c. 退火温度：

退火温度选择标准：提高每一对引物的退火温度，然后在mPCR的时候采取最低退火温度；

d. 引物结构设计：

通过一些独特的结构设计，避免非特异性扩增或者引物二聚体。比如Ω引物，该引物包括三部分，5’端的序列，Ω环，3’端序列。其中两端的序列是和目标区域互补的，而环不是。对于Ω引物，当5端和3端序列完全配对才可以进行目标区段扩增，否则其结构不稳定（因为Ω环存在），导致扩增失败。

常用引物设计网址:

http://www.premierbiosoft.com/primerplex/index.html

https://www.dna.utah.edu/umelt/umb.php

http://people.ds.cam.ac.uk/ssb22/pooler/(only for cancer researchers)

2.2 反应体系

多重PCR的反应体系也是影响扩增效果的重要因素之一，体系中的各组分需满足每对引物对应的靶点的扩增量的要求。

2.3 反应条件

多重PCR反应中会存在以下两种问题：1）目的产物长度不尽相同，而较小片段总是优先得到扩增；2）各对引物的最佳PCR条件也不尽相同，比如较长片段需要更长的延伸时间。因此为了保证最终扩增产物的量尽可能的一致，在优化反应条件的时候，尽可能选择有利于较大片段扩增的条件

3. 常见问题解决办法

多重PCR扩增的时候最主要的问题：二聚体、非特异性扩增以及扩增产物条带较弱。

多重PCR要求在同一反应体系内对多个位点进行特异性扩增。因而引物间的配对与竞争性扩增均会影响扩增效果。如果能选择合适的反应体系以及反应条件则有望提高多重PCR的扩增效果。所以在进行多重PCR的时候，不应墨守陈规，要根据自身实验情况对实验条件进行不断优化，达到最佳扩增效果。

多重PCR的体系优化可以从以下几个方面入手：

1.引物设计：首先需要设计特异性好的引物，特异性差的引物可能会引起非特异性扩增，影响PCR结果。可以利用引物设计软件进行引物设计和评估，如Primer3、Primer-BLAST等。

2.反应条件：PCR反应条件对扩增效率和特异性也有很大影响，需要确定最佳的温度、时间、缓冲液浓度、MgCl2浓度、引物浓度、模板DNA浓度等参数。需要通过实验来寻找最佳的反应条件。

3.模板DNA纯度：模板DNA的纯度对扩增效率也有影响，需要使用高质量的DNA模板，可以通过电泳、比色等方法进行检测和纯化。

4.反应体系：多重PCR需要同时扩增多个靶序列，需要选择合适的反应体系来保证扩增效率和特异性。常用的反应体系包括混合反应体系、联合反应体系和串联反应体系等。

5.其他因素：还有一些其他因素也会影响PCR结果，如引物浓度、PCR循环数、反应体积等。需要仔细优化和调整这些参数，以达到最佳的PCR效果。

关于多重PCR的体系优化，建议可以参考一些相关的文献和视频，比如《PCR技术：原理与应用》、《分子生物学实验技术》等相关书籍，以及一些学术网站和视频网站，如ResearchGate、PubMed等