大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ Klenow 片段实验

实验分类：

DNA 实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

Klenow酶是大肠杆菌八聚合酶I的羧基端片段，它具有DNA聚合酶和3’到5’方向的外切酶活性，不含5’到3”方向的外切酶活性。

来源：丁香实验

操作方法

标记DNA的3‘末端

1. 在20 μl 反应体积中，用可产生5’突出端的限制性内切酶消化0.1~0.4 μg DNA。 2. 加入20 μl Ci所需的［α-32P］标记下dNTP（400~800 Ci/mmol）和1 μl 5 mmol/l 3dNTP混合液。 3. 如需要高比活，可加入80 μCi［α-32P］标记的dNTP，加入1 U klenow 酶，30℃’温育15 min。

修复突出的3’或5‘末端

1. 在20 μl 反应体积中，用限制性内切酶消化0.1~4 μg DNA。 2. 加入1 μl 0.5 mmol/l含各种dNTP的混合液，并加入1~50 U 的klenow酶，30℃温育15 min。 3. 75℃加热10 min或者加入1 μl 0.5mol/l EDTA以终止反应。

随即寡核苷酸引物介导

1. 用合适的限制性内切酶消化DNA，DNA片段经电泳纯化或乙醇沉淀，用TE缓冲液重悬。 2. 在冰浴中混合下列物质：（1）2.5 μl 0.5mmol/l 3dNTP混合液（2）2.5 μl 10×klenow酶缓冲液（3）5 μl 3000Ci/mmol［α-32P］标记dATP （4）1 μl klenow片段