DNA和RNA核酸稳定性问题

qPCR实验中的DNA模板直接用ddH2O稀释就好了，不要用TE buffer，里面有盐离子，会影响PCR效率。

对于标准曲线，尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段，即曲线几乎成直线的范围内。最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度，这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。

注意事项：

1、连接反应的温度：DNA连接酶的zui适反应温度为３７℃，但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过个夜。
2、DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。
3、 碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。
4、连接反应的检测：连接反应成功与否，zui后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。
5、如果要检验连接酶和连接酶的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。

DNA在TE buffer中比较稳定，RNA在无RNA酶的depc水中稳定。制作标准曲线做qPCR，可以用超纯水直接稀释就好，但是梯度稀释