loveliufudan
以下是一份小鼠角膜铺片染血管的protocol,供参考:
材料:
小鼠角膜组织
PBS缓冲液
4% 多聚甲醛
Triton X-100
抗CD31或抗血管内皮细胞抗体
二抗
DAPI或其他核染色剂
荧光显微镜
步骤:
将小鼠去角膜后立即固定在4% 多聚甲醛中,4°C固定过夜。
用PBS缓冲液洗涤样品3次,每次5分钟。
在PBS缓冲液中用0.2% Triton X-100进行细胞膜破裂,30分钟。
洗涤样品3次,每次5分钟。
加入抗CD31或抗血管内皮细胞抗体,室温孵育2小时。
洗涤样品3次,每次5分钟。
加入荧光标记的二抗,室温孵育1小时。
洗涤样品3次,每次5分钟。
加入DAPI或其他核染色剂,室温孵育15分钟。
洗涤样品3次,每次5分钟。
将样品铺在载玻片上,用透明胶封口。
使用荧光显微镜观察和拍照。
需要注意的是,在实验中可能会出现一些问题。例如,如果细胞膜没有完全破裂,可能会导致抗体不能充分与细胞膜结合,从而导致染色效果不好。此外,抗体浓度和孵育时间也可能会影响染色效果。因此,需要根据实验条件进行适当的优化。
cubeamy1905
你好,我的实验流程和你这里的差不多,但是染色效果确实很差。请问通透这一步不理想应该从哪里着手,tritonx的浓度吗?另外,用什么CD31抗体比较有保证?有推荐吗?我用过proteintech和abcam的,但也不排除是破膜不完全导致抗体效果不好
毛利小五郎的徒弟
第一步:心脏灌流固定
小鼠麻醉后,仰卧位固定小鼠四肢, 剪开胸腔,充分暴露心脏,在心尖左旁2 mm处用输液针头刺入并剪开右心耳, 迅速灌注生理盐水100mL, 肝肠变白表明灌注成功, 旋转输液开关, 再灌入多聚甲醛溶液100 mL, 小鼠四肢抽动表明灌注固定液成功, 待抽动完全停止、全身组织器官变硬后摘取眼球,再用甲醛固定25 min。
第二步:角膜铺片
取出眼球置于载玻片上,用吸管滴一大滴生理盐水于眼球上保证眼球完全浸没于水滴中 眼科显微镊(带齿)夹住总腱环,用显微剪沿总腱环将角膜剪下,暴露并挤出晶状体(椭球状);除去角膜、虹膜、晶状体用齿镊夹住视神经,无齿镊将视网膜挤出,展开呈碗状,滴一滴生理盐水在上面,以视盘为中心, 放射状切开4刀, 呈四叶草状,去除色素颗粒, 神经层向上展平,加数滴PBS, 轻轻漂洗干净。
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