蔗糖密度梯度离心分离细胞组分

1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3 次后,置- 20 ℃冰箱中,备用。

2、先以5000g离心15分钟后，获取上清夜，然后再20000g高速离心30分钟后取上清液。

3、接着10万g超速离心2h，将沉淀用少量STE溶解。

4、先在超速离心管中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的溶解液，然后在离心管中依次加入30 % , 45 % , 60 %的蔗糖,加的时候是用长针头从底部往上加的。11万g离心2.5h,发现在30 %与45 % 以及45 % 与60 %之间都有一条明亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，分别收集到不同的瓶内。

5、去蔗糖；用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后11万g离心3h,用少量STE（根据沉淀的量决定加入多少）缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。-20度冻纯备用，用时可用分光光度计测定其病毒含量。

步骤如下：

（一）组织匀浆制备

A 取材 将空腹 12 h 的大鼠拉颈处死。剖开腹部，迅速取出肝脏，用生理盐水洗净血污，滤纸吸干。

B 制备匀浆 称取约 2 g 左右的肝组织，用预冷的 0.25 mol/L 的蔗糖溶液冲洗数次，再剪碎。以预冷的 0.25 mol/L 的蔗糖溶液悬浮剪碎的组织（9 ml/g），倒入匀浆器内，在冰浴条件下匀浆。匀浆完成后，用双层尼龙布过滤，即制得肝细胞匀浆，备用。

（二）密度梯度离心法分离细胞器

A .细胞核的分离 组织匀浆 2000 g 离心 15 min；将分离所得沉淀以适量的 0.25 mol/L 的蔗糖溶液悬浮；离心管内铺制梯度液，2.0 mol/L 和 1.3 mol/L 的蔗糖溶液各 4 mm，将细胞核悬液铺于离心管液面上，100000 g 离心 30 min，取沉淀，即得细胞核。

B .线粒体和溶酶体的分离 将获取细胞核后所得的上清液以 15000 g 离心 25 min，取沉淀，以 0.25 mol/L 的蔗糖溶液悬浮；离心管内铺制梯度液，从上至下分别铺制 0.5 mol/L、1.2 mol/L 和 1.3 mol/L 的蔗糖溶液各 2 mm，将悬浮液加入离心管内，100000 g 离心 3 h，在 0.5 mol/L 与 1.2 mol/L 的界面处可得线粒体，在 1.2 mol/L 和 1.3 mol/L 的蔗糖溶液界面处可得溶酶体。

C .质膜、高尔基体和微粒体的分离 将步骤（2）中 100000 g 离心 3 h 后所得沉淀以蔗糖缓冲液悬浮；离心管内从上至下铺制 1.0 mol/L 和 2.0 mol/L 的蔗糖梯度液，将悬浮液加入管内液面上，200000 g 离心 6 h，可在 1.0 mol/L 和 2.0 mol/L 蔗糖梯度液交界面提取到高尔基体，在 2.0 mol/L 蔗糖溶液中提取到微粒体，在 1.0 mol/L 蔗糖溶液中提取到质膜。

注意事项：

铺制梯度液时要轻轻地将蔗糖溶液铺于管内的液面上，应见到明显的界面，否则会影响分离效果。

以下是一般的操作步骤和注意事项，供您参考：

1.材料：

细胞培养物

冰冷的PBS

离心管

1.12 g/mL 和 1.23 g/mL 蔗糖溶液

超速离心机

2.操作步骤：

将细胞培养物离心收集细胞，去掉上清液。

用冰冷PBS洗涤细胞2-3次，使细胞完全悬浮在PBS中。

向1.23 g/mL 蔗糖溶液中加入细胞悬液，混匀。

将1.12 g/mL 蔗糖溶液加入离心管底部，制备一个蔗糖密度梯度。

缓慢将混合的细胞悬液加入离心管中，避免与1.12 g/mL 蔗糖溶液混合。

离心管放入超速离心机，离心 1-2 小时，以 25,000-40,000g 的速度离心。

离心后，分离出不同密度层，取出含有目标细胞组分的层进行后续的分析。

3.注意事项：

细胞悬液加入离心管时，需要慢慢加入，避免与低密度的1.12 g/mL 蔗糖溶液混合。

离心速度和时间需要根据具体实验条件进行调整。

离心后分离出的不同密度层需要立即取出，以免不同层之间的混合。

使用此方法分离细胞组分时，需要考虑细胞的特性和目标组分的密度等因素，以确定最佳的离心条件。