急求助蔗糖密度梯度离心法提取突触上和突触外蛋白的步骤

体积一般都是十倍体，蔗糖的浓度可以选择30 % , 45 % , 60 %的蔗糖，加的时候是用长针头从底部往上加的。

1.制备蔗糖密度梯度：按照一定比例在离心管中加入不同浓度的蔗糖溶液，形成密度逐渐递增的密度梯度。

2.加样：将待分离的混合物加到离心管中密度梯度表面。

3.离心:使用高速离心使样品在密度梯度中沉降，不同密度的生物分子将按照密度大小在不同位置聚集。

4.收集:根据不同密度的分子沉降位置，可以收集到目标分子的纯化层。蔗糖密度梯度离心常用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的分离和纯化，具有选择性强、分离效果好、操作简便等优

点。

突触体分离

1.按1:10(1g:10ml)的比例投入冰冷的 PH 7.4匀 冲液，用匀 器制匀后移至闪心管。

2.离心 1,000gx10 min，将上清液 S1移至干 管。离心 16,000gx20 min，留取沉淀 P2 。

3.将沉淀溶于 10 倍体 的 0.32 mol/L 蔗糖液 。

于蔗糖梯度上(0.8 mol/L 【27%】和 1.2 mol/L 【41%】各 1.5ml)离心 65.000g x 45min。收集 0.8mol/L与 1.2 mol/L蔗糖界面之 的致密物。

4.用 PBS 溶液(pH7.4)洗去蔗糖，再离心 16,000g x 30min收集沉淀即 突触体。

以下是一般的步骤，关于体积的选择可以根据实验设计和具体细胞类型进行调整：

1. 制备蔗糖密度梯度溶液：根据实验需求和细胞类型，制备一系列浓度递增的蔗糖溶液，通常在10-60%之间。您可以使用不同的浓度，如10%、20%、30%、40%、50%和60%蔗糖溶液，以形成密度梯度。

2. 细胞裂解：将细胞样品收集并裂解以释放蛋白质。您可以使用适当的细胞裂解缓冲液来破坏细胞膜，并释放细胞内的蛋白质。

3. 样品制备：将裂解的细胞样品以适当的体积转移到离心管中。确保样品中没有细胞碎片或细胞核等固体颗粒。

4. 密度梯度离心：将样品小心地层叠在蔗糖密度梯度溶液上。体积的选择取决于细胞数量和样品的浓度。一般而言，较低的细胞数量和浓度可以使用较小的体积（例如100-200 μL），而较高的细胞数量和浓度可能需要更大的体积（例如500 μL或更多）。确保样品层叠均匀且无气泡。

5. 离心：将装有样品的离心管放入超速离心机中，并进行离心。离心的参数可以根据您的实验需要进行调整，通常在低速和长时间离心，例如20,000 x g离心30-60分钟。这将使样品在密度梯度中沉降并分层。

6. 分层收集：离心结束后，您可以从离心管中以适当的体积分层收集突触上和突触外蛋白的特定层。通常，突触上蛋白质富集在较轻的密度层，而突触外蛋白质则富集在较重的密度层。体积的选择取决于您对蛋白质含量的需求和后续分析的方法。