如何对细胞组分进行分级分离

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试想一下，若没有各种方法来分离组成细胞的不同区室和组分，那么现代生物学将困难重重。从细胞信号通路 到新陈代谢，人们一直想知道，它们在哪儿，过去、现在及将来。

赛默飞世尔科技 的市场部经理Monica O’Hara Noonan介绍，研究人员对细胞进行分级分离(fractionate)的原因有很多。他们可能希望，当感兴趣的蛋白在某些条件下或某种处理之后转位时，对其进行追踪。对细胞进行分级分离能增强低丰度蛋白的检测能力，或降低下游分析或功能分析的复杂性。

如果您正在从事这一方面的研究，请继续往下读。从细胞 上讲，我们会帮助您将小麦和谷壳分开。

细胞的组分

如何对细胞进行分级分离取决于很多因素，包括哪些仪器 、知识可以利用，您想要分离什么，以及这些组分的下游应用是什么。

离心是细胞分级分离中最常用的技术之一，它们单独使用，或与其他方法结合。例如，对于高尔基体 或过氧化物酶体，大部分操作都要求高速的密度梯度离心。然而，O’Hara Noonan也指出，超速离心也有一些缺点，包括超速离心机是高价的仪器，有些实验室无法接触到。另外，密度梯度难以倾倒是出了名的，其结果是技术依赖的。

当然，其他的许多组分也可以只利用试剂和台式仪器来富集。供应商开发出一些试剂盒，能方便快捷地带来高度富集的细胞组分。赛默飞世尔 全新设计的Mem-PER Plus试剂盒，能在一小时之内富集完整的膜相关蛋白。

据sigma-aldrich 的产品专家Michael Moehlenbrock介绍，这类试剂盒的原理在很大程度上是类似的。它们往往使用低渗缓冲液给细胞膜带来压力，然后用等渗的提取缓冲液(带或不带还原剂和蛋白酶抑制剂)来维持感兴趣的细胞器。有时也需要机械裂解或去污剂裂解。“各个不同供应商在细胞分级分离试剂盒的设计上都是一致的，而不同细胞组分的差异在于缓冲液组成、裂解试剂和离心速度，”Moehlenbrock说。

此类试剂盒的价值并不在于某些秘密试剂，而在于QC系统的一致性和重复性。“细胞分级分离的方法已经过充分鉴定，其操作步骤适用于大部分应用，”Moehlenbrock说。“商业化试剂盒为最终用户带来了简便和效率，同时提供了品质保证的安全性。”

通过改变穿插在离心步骤之间的缓冲液的去污剂组分，研究人员可分离不止一个组分。例如，市场上许多试剂盒可收集细胞核和胞浆蛋白。其他试剂盒也带来了三个或四个不同的组分。Cell Signaling Technology的Cell Fractionation Kit产生了细胞质、细胞膜/细胞器以及细胞核/细胞骨架组分，而QIAGEN的Qproteome Cell Compartment Kit分离出细胞质、细胞膜、细胞核和细胞骨架组分。

美天旎提供一种不含去污剂的试剂盒，它利用TOM22抗体标记的磁珠来特异分离线粒体。据该公司的技术支持介绍，他们不提供其他亚细胞组分的产品，但客户可以利用自己的抗体来间接分离其他组分。

同样地，赛默飞世尔的Cell Surface Protein Isolation Kit标记细胞表面蛋白的外部赖氨酸，它具有一个可切割的生物素衍生物，让此蛋白组分在细胞裂解后可被捕获。

其中有什么

在细胞组分被分离出来之后，必须验证您的实验，并确认这些组分确实包含了您要分离的。尽管这些试剂盒通常不包含区分各种组分的试剂，但许多会指出不同的看家基因，让您用来确保质量。Moehlenbrock表示：“在某些情况下，我们会提供分析的建议。

”例如，Sigma-Aldrich Mitochondria Isolation Kit的技术指南建议检查细胞色素c氧化酶活性和柠檬酸合酶活性，以确认外膜和内膜的完整性。

Cell Signaling Technology也提供Cell Fractionation Antibody Sampler Kit，作为分级分离试剂盒的伴随产品。生产科学家Jim Cormier介绍，当您在运行Western时，您会得到一个量化值，哪些组分占多少。Sampler Kit包含细胞质MEK1/2、线粒体凋亡诱导因子(AIF)、组蛋白H3和细胞骨架波形蛋白的兔单克隆抗体，以及山羊抗兔IgG。

研究人员也可利用试剂盒中的建议，或搜索文献，组装自己的Western blot或ELISA试剂盒。不过Cormier也提醒，并非每个抗体都有着它应有的特异性。

下游的分析

与超速离心相比，基于试剂盒的细胞分级分离方法快速又方便，也适合多个下游应用，如EMSA、报告基因分析、酶活分析和Western blot。

然而，制备过程中所使用的去污剂和盐可能阻碍蛋白质组学的应用，如质谱，“这有时取决于去污剂的量，去除的容易程度，以及是否用于功能分析，”O’Hara Noonan说。“在某些情况下，您可能需要透析或脱盐。”

同样地，有时可能需要额外的步骤，来增加产物的纯度。在读研究生时，Moehlenbrock一般使用台式离心机来制备线粒体。“有时我会用11,000 x g来去除细胞碎片。之后获得线粒体提取物，并用蔗糖梯度和超速离心机来进一步纯化。这取决于您想做什么，”他回忆道。