钙调蛋白的粗分级分离实验

上清 固体硫酸铵 浓硫酸 Tris 碱 缓冲液 B
聚丙烯烧杯 磁力搅拌器与搅拌子 聚碳酸酯离心管 超速离心机 带刻度的聚丙烯量筒 粗棉布 聚丙烯漏斗 橡皮淀帚 刮勺 透析袋

材料与设备

上清，得自实验 2(约 700~1000 ml)

固体硫酸铵

聚丙烯烧杯（2x4000-ml)

磁力搅拌器与搅拌子

聚碳酸酯离心管（6x500-ml)

超速离心机，备有 3000-ml 容积的转头

带刻度的聚丙烯量筒（2x4000-ml)

粗棉布

聚丙烯漏斗（大的，宽嘴型）

浓硫酸（稀释至 50%v/v 水溶液）

橡皮淀帚/刮勺

Tris 碱（1mol/L; 约 10 ml)

聚丙烯漏斗（小的，具长茎的）

透析袋（标称截留分子量 6000~8000Da; 洗浄)

试剂

缓冲液 B(10x)(临用前配制 4000 ml 1x 缓冲液 B，并加 2-巯基乙醇至 1 mmol/L)

(配方，见“试剂的配制”，PP.82~83)

操作程序

1) 以实验 2 所得上清的体积为基础（减去为测活而取出的等分试样，于硫酸铵表 (见附录 4) 上査出配成 0%~60% 饱和度所需的固体硫酸铵量。应为 361 g/L。称取适量硫酸铵，并将团块研碎成细粉 。

2) 将上清置 4000-ml 聚丙烯烧杯中，并放人大的磁力搅拌子。置冷室的大磁力搅拌器上慢慢搅拌。于 20 min 内缓慢抖动加人硫酸铵。如固体硫酸铵沉于烧杯底部，可停几分让其溶解。然后再继续搅拌 40 min(即，共 60 min)。

3) 将混合物转至 500-ml 聚碳酸酯离心管，平衡后，置超速离心机中，4°C,8000r/min 离心 60 min。

4) 移出上清，倒人铺有两层粗棉布的聚丙烯漏斗后收集于带刻度的聚丙烯量筒中。弃去沉淀物。记录上清液的体积。留 1% 的体积供以后测活用。你将需要这两个体积作计算。

5) 将上清移至 4000-ml 聚丙烯烧杯。用 pH 计测量，中速搅拌，加 50%(v/v) 硫酸溶液，至 pH 达约 4.05。努力让 pH 低于 4.1 髙于 4.0。

6) 烧杯置冷室, 搅拌 1h。

7) 将上清移至 500-m l 聚碳酸酯离心管。于超速离心机中，4°C,8000r/min 离心 60 min。

8) 移出上清并弃去。用橡皮淀帚，重悬沉淀物于几毫升含几滴 1mol/LTris 碱的蒸馏水中。应以最小的体积重悬沉淀物。

9) 戴上手套，将悬液转移至透析袋。用具长茎的聚丙烯小漏斗灌人透析袋。排出过量的空气，留出 50% 空余（透析袋应是瘪的，无空气）。透析袋两头至少打双结扎紧或用夹钳夹紧。

10)40°C 下，对蒸馏水透析 4 h, 其间换液一次。然后，转至 4000 ml lx 绥冲液 B 中，继续透析过夜（4°C)。在所有透析的情况下，均由小搅拌子在烧杯中缓慢搅拌，混匀透析液。不能让搅拌子碰击透析袋，否则透析袋会破裂。