求助免疫电镜

免疫电镜是一种结合免疫学和电子显微镜技术的方法，用于检测细胞或组织中的特定蛋白质或抗原。以下是一般的免疫电镜步骤：

制备样品：样品可以是细胞或组织，需要进行固定和包埋处理。固定通常使用戊二醛或氧化亚铊等交联剂。包埋处理通常使用树脂，如Epon或Araldite。

切片：用超薄切片机将包埋样品切成70-100纳米的薄片，然后将其放在电镜网格上。

抗体标记：将特定的抗体与金颗粒等标记物结合。抗体可以是单克隆或多克隆的，标记物可以是金颗粒或荧光染料等。标记抗体通常需要与样品进行预处理，例如用牛血清白蛋白（BSA）或牛血清浸泡样品来防止非特异性结合。

免疫反应：将标记的抗体滴加到电镜网格上的切片上，让其与样品中的目标蛋白质结合。通常需要进行一些洗涤步骤，以去除非特异性结合的抗体和标记物。

染色：将切片用酒精和重金属染剂如铀酸或铅酸染色，以增强切片的对比度和图像质量。

观察：用透射电子显微镜观察样品中的标记物和细胞结构，拍摄电子照片并进行分析和解释。

需要注意的是，免疫电镜技术比较复杂，需要专业的技术和设备支持，操作时需要谨慎并遵循安全规范。

实验步骤

1. 标本处理

1) 细胞悬液：用10ml PBS内含1mg/ml牛血清白蛋白(PBS—BSa )悬浮细胞，离心250g，5min×2。加入PBS—BSA 至105-106细胞/ml，振摇成单细胞悬液。

2) 细胞附着于固体支持物：由于固定与免疫标记的孵育过程会引起细胞凝集，妨碍细胞表面的暴露，而且反复的离心与悬浮会导致细胞表面形态的改变。通常将悬液中的细胞粘附于过滤膜或涂有带正电荷聚合物的盖玻片上，在粘附之前可依1)法清洗标本，以除去细胞表面的附着物。固体支持物可用涂有多聚—L—赖氨酸薄膜的载片或直径13nm、孔径0.22或0.45μm的过滤膜。

3) 组织切片与固体组织：组织切片如为石蜡包埋应预先脱蜡，由二甲苯经梯度酒精至水。组织切片与固体组织(勿过大)均应以PBS—BSA冲洗，并保持湿润避免干燥。

2. 固定

1) 固定前用PBS—BSA冲洗5min×3。

2) 选择加入适合的固定剂；可为4%多聚甲醛 0.1%-0.5%戊二醛在pH7.4的磷酸缓冲液中。室温固定10-60min，或4℃30-120min。

3) PBS—BSA冲洗5min×3。

4) 除去残留的自由醛基，选以下任一方法：

0.5mg硼氢化钠/1ml PBS 10min(新鲜配制)

0.05-0.2mol/l 甘氨醊或赖氨酸—HCl/PBS 30-60min。

0.1-0.5mol/L氯化钠/PBs 30-60min。

PBS—BSA冲洗5min×3。

3. 免疫标记与透射免疫电镜的原则及步骤基本相同。

1) 血细胞以PBS—BSA冲洗5min×3。

2) 2%多聚甲醛—戊二醛混合液固定，4℃，1h

3) PBS或TBS反复冲洗5min×3。

4) 胶体金免疫标记程序(略)

5) 暗室显影液显影

6) 扫描电镜样品制样

7) 观察

4. 常规扫描电镜标本处理

1) PBS—BSA冲洗5min×3。

2) 后固定：2.5%戊二醛0.1mol/L磷酸缓冲液，时间视样本大小而定，一般室温30min左右。

3) PBS—BSA洗5min×3。

4) 1%四氧化锇后固定1-2h

5) 系列梯度乙醇或丙酮脱水

6) 临界点干燥或冰冻干燥

7) 喷镀碳与金

8) 扫描电镜观察