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我不知道能否描述的清楚,是这样我有好几株不同条件下处理的细胞,想看看他们最终分化的效率是否有影响,通过染色几个标志物,但问题是处理后的细胞条件不一样了,有些细胞贴壁就很正常,有些就贴壁不牢了,最后同一条件染色完成后,有些上面只有十分之一的细胞了,但我最终想看到是分化效率,贴壁牢的细胞效率就只有 70左右,然而贴壁不牢的细胞正常情况下效率要么更低,要么和正常的一样70呗,结果竟然90以上,我是怀疑是不是因为细胞太少了,所以同样染色条件下所以更容易染色?所以效率更高的假阳性结果?有没有类似经验的伙伴帮忙指导一下!
府宅
内源性原因就是你的细胞长的太密了。外源性可能是你转染造成的。还有可能更你做一抗二抗有关。
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与蛋白表达、抗体选择、孵育时间温度及荧光显微镜应用都有一定的关系
dxywode
常见问题一:信号弱或无信号,染色细胞过少
可能原因:
1.目标蛋白在细胞中没有表达
2.表达目标蛋白的细胞过少
3.细胞通透性差
4.染色前的固定步骤破坏了抗原表位
5.通透使抗原丢失
6.抗体不识别
7.一抗稀释度过大
8.二抗选择错误
优化方案(与以上原因相对应):
1.制备细胞裂解液,用Western Blotting验证目标蛋白在细胞中是否表达
2.标本中使用更多的细胞,试用其他瞬时转染方法,或者使用稳定转染细胞系
3.增加通透剂作用的时间或者浓度,或改用其它的通透剂
4.改用其他固定方法
5.减少通透剂作用的时间或强度
6.换用其他抗体
7.同一样品按zui佳的二抗用量作一抗稀释曲线,以确定zui佳的一抗稀释比例
8.使用正确的二抗