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小分子蛋白(15kd)wb跑不出,且在15kd附近一团阴影?

相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

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dxy_5dyzhe4r

请问各位前辈们,我用13%、15%的胶跑小分子蛋白LYZ(约15KD),电泳条件:70V 40min,120V 45min,转膜条件:250mA,30min。但是15KD附近的条带总是一大团,还不如上面的非特异性条带明显,请问各位前辈们是否知道是什么原因?

谢谢!

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5 个回答

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feixue7758527w

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我觉得还是有杂质的,你可能要精炼一下蛋白,然后跑胶的时候时间稍微长一点,如果还是不行,就建议配胶的浓度变大一点试试。

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huarenqiang5

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考虑以下几点原因及处理建议:

1、蛋白降解;对策:于冰上提取,buffer 里加蛋白酶抑制剂防止降解。

2、样品保存不当;对策:提取后尽快测定浓度,

并煮沸变性,未煮沸样品保存置于 -80 ℃ 保存。

3、胶浓度较低,容易跑过头;对策:换用浓度较高的胶,例如 15% 或者用梯度胶。

4、转膜时间太长,小分子蛋白转过头;对策:减少转膜时间,可尝试 200-250 mA 转 15-30 min 左右。

5、膜孔径太大;对策:换用小孔径如 0.2 μm 的 PVDF 膜。

6、running buffer 不合适;对策:换用 Tricine-Glycine。

7、抗体特异性不佳或失效等其他原因;对策:参考文献选择合适的抗体更换。

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毛利小五郎的徒弟

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提高一下分离胶浓度,考虑是分离胶浓度太低导致的小分子跑不出结果

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loveliufudan

有帮助

可能是由于几种原因造成的:

1. 蛋白负荷过高:如果在电泳过程中加载的蛋白负荷过多,特别是在目标蛋白质的分子量范围周围,可能会导致条带过于密集和模糊,难以区分。尝试减少加载量可能有助于解决这个问题。

2. 转移条件不当:不正确的转膜条件可能导致条带模糊和重叠。过高的电流或时间可能会导致蛋白质在凝胶中迁移得太快,使得特定的条带无法清晰分离。你可以尝试调整转膜条件,例如减少电流或转膜时间,以获得更好的结果。

3. 凝胶浓度选择:选择合适的凝胶浓度可以影响蛋白质的分离。对于较小的蛋白质,使用较高的凝胶浓度可能有助于提高分辨率和条带清晰度。

4. 蛋白质结构和交联:某些蛋白质具有自身的特殊结构或交联状态,可能导致它们在电泳过程中以不寻常的方式迁移,从而形成模糊的条带。这可能需要进一步的优化和调整来解决。


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balalaLy

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抗体的特异性不好再加上蛋白表达量低就会这样。可以增加上样量,明确蛋白的大小位置,显影的时候截去大部分多余的位置,这样可以提高目标位置的显影效果。

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