且行且尽力
跑的是TNF-a,18%的胶,0.22NC膜,转膜条件是400mA,30min。5%牛奶封闭30min,一抗比例1:1000,4°C孵育了3天,显影是条带上有黑色斑点,洗不掉,请问是什么原因呢?
loveliufudan
出现黑色斑点可能有多种原因。以下是一些可能的原因和解决方法:
1. 抗体反应:可能是一抗或二抗与非特异蛋白结合,或者抗体自身发生了过度聚集。解决方法可以尝试降低抗体浓度,或者缩短孵育时间。3天的一抗孵育时间可能过长,通常过夜孵育就足够了。
2. 封闭液:如果封闭液未能完全覆盖滤膜,或者封闭液中的牛奶粉未能完全溶解,都可能引起斑点。应确保封闭液的制备正确,使用新鲜的封闭液,且封闭时液体充分覆盖滤膜。
3. 洗涤步骤:不充分的洗涤可能会导致残留的抗体在显影时形成斑点。应确保在每次抗体孵育后进行充分的洗涤。
4. 显影剂:如果显影剂老化或者污染,也可能在显影时形成斑点。确保显影剂的新鲜和纯净。
5. 滤膜处理:在处理滤膜的过程中,如果使用的工具(如镊子)不洁净,或者触摸滤膜的手套有污染,也可能引起斑点。处理滤膜时应确保工具和手套的清洁,尽量避免直接接触滤膜。
毛利小五郎的徒弟
WB 结果出现黑色斑点,最常见的原因是封闭液中出现了不溶性物质。不溶性颗粒附着在膜上,就会导致发光时候膜上出现黑点,这时建议将封闭液充分溶解后进行过滤。
且行且尽力
请问我用奶粉封闭,当时还做了其他抗体,为什么其他条带上都没有黑色斑点呀,只有这个抗体上有呀
sswei
出现黑点或黑斑原因:
(1)一般出现这种情况可能是封闭液溶解不完全或封闭液存放时间太久;
(2)抗体中可能存在杂质;
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