求问Sf9细胞表达
dxy_0sn6q2aq
我们是用pFastbac dual载体共表达两个蛋白（一个250kD，一个30kD)，将质粒转座到DH10Bac感受态后提bacmid在12孔板内转染Sf9扩增P0代毒，我们上次同时做了6个bacmid，其中三个带有荧光蛋白标签，转染后可以看到明显的荧光（至少70%荧光），收P0后将细胞裂解做WB发现只有两个表达了目的蛋白，但是其他几个是别人文献里验证过能够表达的克隆，我的序列跟文献里的一摸一样，在P0代就不能检测到目的蛋白，在后面的P1和P2中更是检测不到。而且最奇怪的是，WB阳性的两个毒在P1和P2以及最后的表达当中都没有验证到有蛋白表达。我有以下疑问，希望做Sf9的朋友能够帮忙解答：
- 是否存在这种扩增过程中毒株丧失表达目的蛋白的能力，而作为指示的荧光蛋白依然能表达？
- 在转染初期最需要注意的问题是什么？我用PCR和测序的方法验证过我的bacmid是没有问题的，而且我的荧光蛋白也能正常表达，为什么别人成功表达的蛋白到我手上无法重复出来了？除了bacmid的原因还有其他的嘛？
3 个回答
汤姆卜丽波
可能是你的荧光蛋白选择有问题，也可能是合成时它与目的蛋白的位置导致目的蛋白被折叠不表达或者被切割
huarenqiang5
主要原因有：载体构建错误、宿主菌选择不当、质粒不稳定或质粒丢失
土井挞克树
可能是这种扩增过程中毒株丧失表达目的蛋白的能力，而作为指示的荧光蛋白依然能表达
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