求助：WB条带背景太黑是什么原因呀

搬砖狗啦啦啦

2022-09-27

10%分离胶 5%浓缩胶

电泳 loading buffer 20微 marker 1微蛋白20微

90V跑到marker分离出来溴酚蓝大概在分离胶

接着换140V跑到溴酚蓝到最下面

转膜100min 350V NC膜

封闭脱脂奶粉 2g+TBST40g 2h

剪膜跑的是贝塔actin

一抗 4度摇床过夜这次时间久了大概21h

二抗室温1.5h

学姐跑出来的都很好

和我的实验只有蛋白配胶试剂和膜抗体不一样

蛋白是自己提的不知道含量

我用的配胶试剂是自己配的学姐是碧云天试剂盒的

电泳液比较久 10✖️的至少几个月了

但是感觉电泳没啥问题

转膜液比较新 marker也转上了

抗体之前有老师说可以跑出来但是是暑假前一个月

暑假一直4度保存

跑出来的条带如图背景太深

NatureBios

2022-10-04

有帮助

这个现象考虑1 milk 完全溶解(超声一下除气) 延长封闭时间(或过夜) 2 清洗次数增加一次(注意ph值) 3优化一下一二抗浓度

毛利小五郎的徒弟

2022-09-27

有帮助

一抗浓度过高，或者孵育时间过长。

秋秋欣欣

2022-09-27

有帮助

可能是你的一抗，二抗抗体浓度太高

balalaLy

2022-09-27

有帮助

marker转膜成功说明前面的步骤应该都没有问题，唯一不能确定的是你的蛋白有没有提取成功。另外，抗体4度保存一个月肯定不行了吧。你的实验从配胶的试剂到抗体都是有各种不确定性，作为新手菜鸟，这么操作你可能要走完所有的坑你才能做出比较漂亮的结果哦。建议你先借别人的可以用的蛋白和抗体跑一下。

求助：WB条带背景太黑 是什么原因呀