融合蛋白之间，可用两个酶切位点代替linker吗？

不可以的

简单的说：1.要遵循引物设计的基本原则,，重组表达的引物相对容易设计一点（因为位置固定）；
2.目的产物是：蛋白1+linker+蛋白2，则需插入载体的目的片段为“酶切位点1+蛋白1+linker+蛋白2+酶切位点2”
3.那么想获得这个目的基因片段，则需要设计4个引物，分两步进行。
1）引物：P1——> 5'- 内切酶1+蛋白1上游 -3' （正向序列）
P2——> 5'- linker+蛋白1下游 -3' （反向互补序列）
P3——> 5'- linker+蛋白2上游 -3' （正向序列）
P4——> 5'- 内切酶2+蛋白2下游 -3' （反向互补序列）
2）首先以 蛋白1的模板+P1、P2 ——> 获得 蛋白1+linker 片段；
蛋白2的模板+P3、P4 ——> 获得 linker +蛋白2 片段；
3）第二部回收两种片段的PCR产物后，混合作为模板，以P1、P4做引物，PCR即可得到目的片段

这就是传说中的重叠延伸 PCR（splicing by overlap extension-PCR，SOE-PCR

不能，linker序列和酶切位点是不一样的，酶切位点没法转弯

不可以的，应该说最好不要，没有Linker的功能区域直接融合可能会导致许多不良的结果，包括融合蛋白的错误折叠、蛋白产量低或生物活性受损等