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可能的原因及建议:
①你所检测的样本中不表达目的蛋白,选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性,同时查阅文献。
②检测样本低表达目的蛋白,提高上样量,裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
③转移不完全或过转移,可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流。
④抗体不能识别测试种属的相关蛋白,购买抗体前应当认真阅读抗体说明书,确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
⑤一抗孵育时间不足,建议4℃结合过夜。
⑥二抗与一抗不匹配,选择针对一抗来源的种属的抗体。
⑦洗膜过度,洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。
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如果信号低,可以增加上样量,或者提高抗体浓度。
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解决方法:
将转膜后的胶染色确定转膜效率;同时可用丽春红染膜;
优化转印时间和电流,分子量大的蛋白可以适度延长转印时间;
实验中加入阳性对照和/或 Marker;
按照膜的使用说明预先润湿膜;
转膜过程中胶与膜完全接触,
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转膜不完全和转膜过度都会导致转膜效率低,而导致在检测鉴定是出现信号弱的情况出现。优化转膜条件可有效提高转膜效率。