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各位前辈,WB蛋白定量怎样缩短时间呀?我总是1个多小时,太耗时间。

相关实验:蛋白质的定量测定实验

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举个栗子ok

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5 个回答

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vae1476

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我用BCA定量的,每次只需要半小时,,需要注意以下操作,1蛋白浓度不要太高太低,稀释比例合适,不用二次稀释,2,标准曲线操作注意,r值要一次就超过0.999。3设置复孔,防止误差太大

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whilt-shirt

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可以用超微量核酸蛋白检测仪检测,快速便捷

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bamboopiggy

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如果你每次实验稳定,可以直接用一批试剂,只第一次做标曲,后面只做样品的bca就行,差不了太多。

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天一湖医者

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蛋白定量法

开始之前我们有必要复习一下理论知识。蛋白定量至少有 5 种方法: BCA,Bradford,双缩脲法(Biuret 法),Folin 法(Lowry 法)和紫外分光光度计法。

BCA 法的原理是在碱性条件下,氨基酸将二价铜还原为一价铜与 BCA 形成紫颜色的络合物,测定 562 nm 的 OD 值,所以如果样本里有还原剂(比如 DTT)的话就会对 BCA 的结果产生干扰。

Bradford 法(考马斯亮蓝法)是在酸性条件下,加入考马斯亮蓝 G250 与蛋白质(主要是碱性或芳香族氨基酸)结合为蓝色化合物,吸光度值从 465nm 变成 595 nm,最后测定 595 nm 的 OD 值来计算蛋白质浓度。

双缩脲法或 Folin 法由于检测灵敏度不够高,早已被 BCA 或 Bradford 法所代替。

而紫外分光光度计法是利用氨基酸在 280 nm 处有吸收峰来定量,由于不同氨基酸吸收峰值略有不同,故在蛋白质成分单一的情况下使用佳,比如蛋白纯化后估测蛋白的浓度。

每个实验室都有各自的传统,在方法选择上青菜萝卜各有所爱,但绝大部分实验室要么用 BCA 要么用 Bradford 法进行蛋白定量。

下图简单总结了一下 BCA 和 Bradford 法各自的优缺点。

快速测蛋白法

显然,要想加快速度最好是选用 Bradford 法了。但是,Bradford 也存在一些问题,比如标准曲线线性相关性不佳,容易受 Triton,SDS 等去垢剂的影响等等。

好在我们都是站在前人的肩膀上,前人早已开发出去垢剂兼容型的 Bradford 试剂,性能优于常规 Bradford 法,比 BCA 法更快更方便。今天我们讨论的方法就是基于去垢剂兼容型的 Bradford 试剂来快速蛋白定量。不知道上哪里买的同学可以在丁香通上找找。

下图就是用 Bradford 法测出的标准曲线。虽然线性拟合不佳(R = 0.9667),但是二项式吻合度却非常高(R = 0.9994),可以说非常完美了。

下图展示了如何在 excel 中制作二项式标准曲线。

到此为止,前面我们担心的几个问题就已经全部解决了。第一,担心 Triton 或 SDS 的影响,我们用去垢剂兼容性的 Bradford 试剂

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未来9

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要想加快速度最好是选用 Bradford 法了。

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