请问有做磷酸化的蛋白，造模时间不同，做出来结果完全相反的吗？

首先得确定造模是成功的，建议重复试试

这个可能不是你造模的原因。是你处理样品的原因，加点磷酸酶抑制剂试试。

转膜的时间根据磷酸化蛋白的大小，分子量大时间就长点；分子量小，时间就短点，不可转膜不完全，也不可把膜转过头了。这样都将导致磷酸化蛋白量少，条带过淡。

1.磷酸化的蛋白样品不稳定，请确保样品可靠性，最好正确使用新鲜的样品。
2.拿到一抗、二抗请及时分装保存使用，如果老板有钱就买原装进口的二抗（千万不要用分装的）。
3.建议你摸条件的时候设计好逐层改变条件，最好同时进行平行实验