天一湖医者
一步法
优点: 只需一步,反应发生在单管中,速度比两步法更快,而且需要较少的准备和操作时间。
处理大量样品时易于操作,减少污染的机会。
整个cDNA样品都被扩增,灵敏度更高。
缺点: 同一样本只有有限数量的目的基因被扩增。另一个挑战是组分的兼容性,因为一步法需要转录和扩增之间的平衡。
两步法
优点: 可以分析同一样本的多个目标。
逆转录步骤将样本中所有的RNA转换为cDNA,可以储存cDNA用于后续实验,检测大量基因能够分别优化RT和PCR步骤,可以更好地控制实验过程。因为只有少量的转录材料用于PCR,任何可能从RNA分离到RT反应的抑制剂(如乙醇、苯酚或胍盐)都被稀释了。
缺点:它更耗费时间,且带来污染的可能性更高。RT步骤转录所有的RNA以相同的效率,选择这种方法时,应该考虑到启动会影响qPCR的结果。例如,以oligo-dTs 和随机六聚体启动反应可能会带来不同的结果。因此,对于每个RT反应应该使用相同的条件。
迟C迟
RT-PCR包括2步:
1、mRNA逆转录为cDNA;
2、cDNA做模版的PCR。
合而为一就是一步法,分开就是两步法。
逆转录为cDNA后更容易保存,使用效果更稳定;
一步法更快捷,但重复性不好。
bqejjh123
RNA病毒定量不可以用质粒,可用假病毒或培养病毒,一般均用一步法,否则易污染,较好的一步法试剂有ABI、BIODAI、QIAGEN等。
dxywode
lyang556
一步法和两步法各有优点,不能一概而论。如果想对同一样本同时扩增2个以上的基因,那么一步法是从RNA开始的, 即分别取相同量的RNA,然后逆转录,然后加入不同的primer PCR,如果想快速获得某一种基因,当然一步法好,方法简单,但逆转录酶很贵。如果两步法,可将RNA逆转录为cDNA,然后每次加入相同量的cDNA,再加不同的引物PCR,这样可比性强, 而且不需逆转录,直接PCR即可。
bamboopiggy
一步法更方便,更安全一些。毕竟新冠以后,大家对rna病毒,心有余悸。