检测RNA病毒，使用一步法还是两步法？

一步法

优点: 只需一步，反应发生在单管中，速度比两步法更快，而且需要较少的准备和操作时间。

处理大量样品时易于操作，减少污染的机会。

整个cDNA样品都被扩增，灵敏度更高。

缺点: 同一样本只有有限数量的目的基因被扩增。另一个挑战是组分的兼容性，因为一步法需要转录和扩增之间的平衡。

两步法

优点: 可以分析同一样本的多个目标。

逆转录步骤将样本中所有的RNA转换为cDNA，可以储存cDNA用于后续实验，检测大量基因能够分别优化RT和PCR步骤,可以更好地控制实验过程。因为只有少量的转录材料用于PCR，任何可能从RNA分离到RT反应的抑制剂（如乙醇、苯酚或胍盐）都被稀释了。

缺点：它更耗费时间，且带来污染的可能性更高。RT步骤转录所有的RNA以相同的效率，选择这种方法时，应该考虑到启动会影响qPCR的结果。例如，以oligo-dTs 和随机六聚体启动反应可能会带来不同的结果。因此，对于每个RT反应应该使用相同的条件。

RT-PCR包括2步：

1、mRNA逆转录为cDNA；

2、cDNA做模版的PCR。

合而为一就是一步法，分开就是两步法。

逆转录为cDNA后更容易保存，使用效果更稳定；

一步法更快捷，但重复性不好。

RNA病毒定量不可以用质粒，可用假病毒或培养病毒，一般均用一步法，否则易污染，较好的一步法试剂有ABI、BIODAI、QIAGEN等。

一步法和两步法各有优点，不能一概而论。如果想对同一样本同时扩增2个以上的基因，那么一步法是从RNA开始的， 即分别取相同量的RNA，然后逆转录，然后加入不同的primer PCR，如果想快速获得某一种基因，当然一步法好，方法简单，但逆转录酶很贵。如果两步法，可将RNA逆转录为cDNA，然后每次加入相同量的cDNA，再加不同的引物PCR，这样可比性强， 而且不需逆转录，直接PCR即可。

一步法更方便，更安全一些。毕竟新冠以后，大家对rna病毒，心有余悸。