重组载体转化大肠、菌p后送测，结果(十个碱基突变)两个氨基酸突变。老板叫换个cDNA模板再做一次，结果二十个碱基突变，什么原因？

可能是扩增过程出现了错误，建议使用高保真酶，同时提高退火温度，测序正确后再做下一步。

可能酶产物碎了一些，这样连进去就有大有小。如果你引物用的是在载体上的，那很可能扩出大小不同的。如果你引物就是在基因上的，这个好解决，你把退火温度逐渐提高，看看是不是那个不同片段就没了。

2、有的时候发生了片段自连【这个看起来好像很可笑，但其实我发现只要末端有一个碱基配对，时间长的话，片段是可以连接到一起的，这个就跟TA连接实际一样】。

3、你的电泳系统有污染，你把别人的片段给收进去了，这个我确实证实过，我一批克隆40个基因，我曾经在别的克隆中挑出过另外的基因。

4、另一种可能，你T载体上连接的方向问题，如果酶切不彻底，可能同样会造成不同大小片段，这些如果你量很多的话其实在跑电泳回收时候是分不开的，但PCR赶巧了，也许就正好扩出来了【这种情况只限于载体上有你用的酶切位点，而你目的片段上恰恰引入了这连个酶，这个你可以试着画个图看看，把TA连接的正反画画】。

5、DH好像能长很大的，也没关系的，我的有时候就很大点，其实不用放室温，你冰箱4-8℃那层放置1个月，就看出来了。