怎样更好的跑出蛋白条带

样本从制备开始，所有过程不要出错，选择合适的抗体和敷育时间

1）蛋白收集及定量： 首先，自己的蛋白定量是否精准？线性回归几个9？（至少要2个）其次，收集蛋白上清时，切记切记：tips不能触碰到沉淀或吸取少许沉淀！！！因为哪怕是一点点沉淀都会导致该样品的蛋白浓度不均，严重影响蛋白定量的精准性。

（2）上样时要保证各组蛋白浓度一致，同体积或同质量。同时，小心上样，避免蛋白丢失，即有些蛋白加到槽外。

（3）转膜时（湿法或半干转法），特别是半干转法，务必保证上下层滤纸充分浸泡在转膜液中，使之达到饱和。滤纸放到转膜仪上要设法保证滤纸的平整。滤纸与滤纸之间，滤纸与PVDF膜之间尽可能的驱赶气泡。

（4）抗体：一抗用过3次往后就不要用了，直接换新的。内参不齐，其实抗体量不多了或孵育时抗体与目的条带分布不均也是一个主要原因。记住：遇到这种情况：换新抗体，孵育时抗体及条带充分接触且延长孵育时间。

（5）药物或其他外界因素：使用影响围观蛋白的药物作用细胞，如长春新碱、紫杉醇等不要用tubulin蛋白；在做缺氧相关实验时不要用GAPDH；有些药物导致细胞生长发生改变时尽量避免使用actin。其实，当你没注意这些条件时，发现内参不齐，可以再跑下其他的内参条带做进一步验证。

（6）蛋白上样时，样品要混匀，特别是做CO-IP实验蛋白样品中含珠子的一定要充分混匀，别怕麻烦！

（7）分离好蛋白上清，在加Loading buffer，ddH2O前药先把金属浴仪器打开，使其尽快达到预定温度。然后快速于每个蛋白样品中加入LB和水。这样可防止蛋白的继续降解。

1.制胶：

先制分离胶，再制浓缩胶，严格按照制胶说明书来就可以了。需要注意的一点是制胶一定要混匀！混匀！混匀！个人经验是每加一种试剂，就混匀一下，直到最后一种试剂加完。

对于初学者，还要区分制胶的玻璃板是 1.0cm 还是 1.5cm 的，两者需要的制胶液体量是不一样的。另外，玻璃板一定要洗干净，本人平时都是用洗洁精洗干净然后用水冲洗最后用纯水冲洗，再放在烤箱里烤干并晾至室温。

2.点样：

点样的过程很简单，表手抖就 OK 了。再者，点样的过程一定迅速，不然前面的样容易弥散，虽说不至于太影响结果，但对于有强迫症的同学来说还是比较致命的伤害。

3.跑胶：

注意，跑胶时也会出现各种乌龙，如果跑了好大一会儿还不见条带下移，请看一下你的玻璃板是否放反；如果跑胶时发现温度过高，可检查一下正负极是否连接反了。跑胶建议恒压，80V 30min， 120V 60min（这个得具体看目的条带的 位置，时间可相应增减）

4.转膜：

牢记转膜顺序（黑色面-滤纸-海绵-胶-膜-海绵-滤纸-白色面），如若搞不清楚，可想象一下，蛋白质是带负电荷的，应该是往正极方面跑，所以膜应该放在正极面。转膜时要恒流， 285mA—300mA 60min。特别注意的是跑胶时恒压，转膜时恒流这个条件。

5.封闭特异性抗原：

封闭和孵育抗体也是非常关键的步骤，封闭建议大家用 5%的脱脂奶粉， 2 个小时（或者过夜），不建议用 BSA。

6.一抗孵育：

封闭完以后不用洗直接孵育一抗，一抗配置溶液是 3% BSA 的 TBST（注意封闭和抗体孵育用的蛋白，封闭用牛奶，抗体孵育用 BSA，这个条件是决定条带是否齐整及有无杂带的关键），过夜（或 2 个小时）。时间上与封闭错开，如若封闭过夜，则一抗只需要两个小时。

7.二抗孵育：

洗三遍后孵育二抗 1 小时，洗的时间很重要，习惯是洗三遍，第一二三次分别是 5min、10min、15min。还要特别强调的是，孵育和洗膜用的转速是不一样的。孵育是低速，使膜和抗体有充分的接触时间；洗膜时要用高速，以使膜洗得干净。还有，一抗孵育时正面朝下，封闭和二抗孵育时都是朝上。

8.曝光：

当满足了所有以上的实验条件之后，你就可以自信满满地去曝光了。相信我，不管是磷酸化的还是普通的蛋白，都会出现平整光滑的条带。