蛋白质定量实验的注意事项有哪些？

说一个才被老师说的事情，因为封闭时有点事情导致封闭时间过久，结果我的蛋白没有显色，，，本来以为问题不大，结果也不说啥都没有，但基本算是白做了。此外，一抗或者二抗的时间也需要安排好，最好是弄个定时器放旁边

样品应是均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低

　　1 样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细过筛，液体样要混合均匀。

　　2 样品放入凯氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。

　　3 如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，800~1000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。

　　4 有机物分解需要H2SO4量，H2SO4应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4多，为了提高分解温度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：

　　1g样品 K2SO4：H2SO4=7g：12ml 这种比例在国内外都使用，是公认的。

　　还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10 g：20ml

　　5 消化时，如不容易呈透明溶液，可将凯氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂2~3ml，促使氧化。

　　6 在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。

　　7 如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。

　　8 消化剂绿色后继续消化30分钟即可

　　9 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲醛红乙醇溶液。

　　10 氨是否完全蒸馏出来，PH试纸检查馏出液是否为碱性。

　　11 向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。

　　12 蒸馏加NaOH是50%，加的量为H2SO4量的4倍，硫酸量为12ml，则NaOH为12×4=48ml，而且一般高于这个理论值，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不够就变成H2S， H2S是强酸，使颜色变红。

　　13 目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，这样可省略了反滴定，H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收，为保险期间一般用4%

(1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin-酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜一蛋白质溶液。当Folin- 酚乙试剂加入后，应迅速摇匀(加一管摇一管)，使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。

(2)血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。