提取的组蛋白Histone3怎么定量？
丁香实验
我跑的是小鼠胎盘组织，提出蛋白测浓度都没问题，跟之前差不多，但最近开始提出的蛋白跑的WB结果很不好，，而且其他目的分子都跑不出来，之前提的，和现在跑细胞的出来的内参都没问题，不但是一抗二抗有问题，不知道提的蛋白过程有什么问题，各位帮我分析分析说明原因，而且其他目的分子都跑不出来。怎么处理（见下图）
分享
13 个回答
dxy_h7vcp8v3
有帮助
首先检测内参的抗体和你自己目的蛋白是不一样的，从内参和目的蛋白WB来看，说明你自己的蛋白胶及转膜体系都没有问题。就应该在不同的地方找原因，其一检查目的蛋白的抗体是否过期或者长杂菌 ；其二，检查目的蛋白提取所用buffer是否调节至中性PH值，是否其中缓冲液让蛋白质变性导致没有条带 ；其三建议检查下，自己第一次提出来呢过程中的关键试剂，是否在后边提取中做了更换，检查更换的试剂是否正确。
jey1235
有帮助
类似的问题其实存在分析条件不足。
建议所有的有问题的WB全部不要裁膜，然后跑一张考马斯亮蓝的SDS-PAGE。
单看这个膜，严重怀疑样品年度过大，没有做好消化，组织消化匀浆一定要彻底。
H3的WB有个技巧，务必要将核裂解充分，不然很容易出现条带拖尾。然后就是务必要将DNA进行消化处理，否则H3很难显影。切记切记。
ZZDX-YILILI
有帮助
1.内参没问题排除实验过程你的操作应该没有问题。目的蛋白出不来首先考虑一抗是否合适。
2.提取的蛋白质是否按照之前那样提取的，首先确定你的蛋白样本没有问题，可以让别人试试。
3.还有其他分子出不来就考虑一是否这个分子表达量低，按照之前的上样量无法检测到，二就是抗体确定是否没问题。
dxy_bq4uxnd
有帮助
之前都没问题，现在有问题，说明操作是没有问题，内参蛋白没有问题，目的蛋白不显示，可以考虑是否是蛋白抑制剂选择有问题，建议根据目的蛋白选择合适抑制剂后再试试。
dxy_pni5ki46
有帮助
看起来目的带有点杂，似乎是好几条。有可能是蛋白降解，或者是有修饰，所以有不同大小的带
dxy_4uyyu09r
有帮助
提的过程中一定要加蛋白酶抑制剂，在冰上操作，时间尽可能保证裂解的情况下不要太长，基本就没什么问题。保存建议负八十
dxy_w4oj7yoe
有帮助
如果你想知道提蛋白过程有没有问题的话最好给大家简单说一下你的整个纯化流程，否则我们也很难判断。一般我们定量组蛋白的话就是跑胶定量（量比较大就考染），如果要做wb就先定总蛋白，跑一下wb试试，再细致定量。看你的wb感觉背景很高而且有点拖带，样品可以再多煮一煮，上样前离心取上清，先把wb跑好确定你的目的蛋白是提出来的少了还是其他什么质量问题再说
Guoood
有帮助
最近我也有在提组织蛋白，不知道你是手动研磨还是机械研磨，最近改用机械研磨组织提取蛋白后，立马分装变性，效果还不错。要注意下有无蛋白降解，裂解蛋白时可以多加一种蛋白酶抑制剂试试。
z流沙z
有帮助
这个看起来是有条带的啊，可以增加封闭时间，并用牛奶或者BSA配置一抗二抗，tbst多洗一洗
飞天幻雪
有帮助
有可能是蛋白提取的过程中降解了，但还是先排除实验的问题吧，很简单。如果抗体换的新的确认没问题了，你就拿之前好用的样品一起再跑一次，如果之前样品正常的话，那肯定就是你这次的样品的问题了，重新收样，别忘了加蛋白酶抑制剂。
vae1476
有帮助
你的内参和目的蛋白，都有很明显的问题，就是有模糊阴影包裹条带，不是清晰干净的条带，制胶可能要注意一下了，如果样本珍贵，考虑预制胶吧
bamboopiggy
有帮助
考虑是你裂解液中的成分失效，裂解不充分，或者是样品降解了，最好是加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，然后分装小份保存，用三次就不要再用了
verbalkint
有帮助
h3分子量比较小，有可能胶配得不好，大蛋白分辨率较低。或者有可能蛋白有降解，大蛋白会比小的更容易降解
相关产品推荐
相关问答
提问
扫一扫
实验小助手
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序