登录
提问
提问
我要登录
｜免费注册
GSTpulldown诱饵蛋白不结合柱子怎么办？
丁香实验
用大肠杆菌表达了一个大肠杆菌的GST标签原核蛋白，载体是pGEX-6P-1，蛋白表达出来了，而且在上清，通过GSH纯化柱纯化过后浓度有大概2mg/ml的样子，挺明显的条带，然后用TBS透析了一晚，但是做GST-pull down(赛默飞官网买的试剂盒)发现诱饵流过的样品里有诱饵蛋白的条带，猎物流过的样品里有猎物的蛋白条带，但洗脱液什么都没有，这种情况是不是诱饵蛋白没有结合到柱子上？怎么解决？
分享
28 个回答
小布丁瑶瑶
有帮助
可能是标签包起来了，可以尝试变性纯化
dxyhsx123
有帮助
第一，柱子是否合适？第二，结合实践是否够长？第三，洗脱速度是否合适？
z流沙z
有帮助
有可能是没有结合上，另外要确认是否构建成功和诱导表达，可以考虑换个标签试试，设置阳性和阴性对照
JCorona
有帮助
可能的原因：1.使用的试剂有问题，结合不牢固，在清洗步骤被洗掉；2.特异性过强，导致洗脱液竞争力不够，无法洗脱
没有详细的操作步骤，无法给出解决方案，建议多参考大家提出的可能原因，具体问题具体分型，针对性地解决。
内科小护士
有帮助
蛋白挂不住，出了填料失活之外，主要的是要注意上样的流速不要太快，尽可能慢点，快了结合不上。
是小杨同学
有帮助
估计是诱饵蛋白没有结合上，可以看下是不是gsh导致的gst没有结合到
lzy必有我师
有帮助
第一，换根柱子。 第二，确认带标签的蛋白表达成功。不过相比这条已经确认过了 第三，确认his标签正常，没有形成包涵体
vae1476
有帮助
请问有没有设置阳性和阴性对照呢？通过对照可以判断有没有结合。
医往情深丁香园
有帮助
可以考虑换根柱子，其次确认带标签的蛋白表达成功。不过相比这条已经确认过了，最后确认his标签正常，没有形成包涵体。可以用anti-his做个wb。“洗掉好多”是跑胶验证了嘛？
ZZDX-YILILI
有帮助
1.两个流出液中都有蛋白，也并不能说明就没有结合，或许是你投入的两个蛋白量都比较多，结合达到类似饱和是程度，所以多余的就流出来了。
2.也许是真的没有结合，那样就需要摸索结合体系。
3.设置阳性和阴性对照，这样方便判断有没有真正结合。
verbalkint
有帮助
很有可能是没结合到柱子上。把trash和flow through收集再过一遍gst的柱子，换一个新的。另外做个gst pulldown看看标签表达了没有
dxy_qkedgrg7
有帮助
我们在用GST标签进行pulldown实验的时候也有挂不上柱子的，大概率是标签被折叠在了蛋白内部，需要从新构建载体。
一支肾上腺素
有帮助
蛋白都是包涵体，这种情况最好先优化一下诱导条件，把诱导温度降下来，甚至可以16度诱导过夜，看看能不能提高蛋白的可溶性。蛋白挂不住，出了填料失活之外，主要的是要注意上样的流速不要太快，尽可能慢点，快了结合不上。
dxy_bq4uxnd
有帮助
可能是GST标签被折叠在了蛋白内部，无法与柱子结合，这种情况可能需要调换GST标签的位置。
dxy_h7vcp8v3
有帮助
如果两个蛋白都没有问题的话，可以增强蛋白与磁珠孵育结合的时间。其二检查是否试剂盒过期。其三增加蛋白浓度。其四检查是否孵育buffer的ph值使蛋白失活。
jey1235
有帮助
描述没太看懂，提几点建议：
流穿有可能tag掉了，有可能GSH残留，有可能GST-protein 处理变性。
1.首先确认GST-beads能够binding到target protein，说明tag没问题。
2.GSH洗脱后需要透析，另外不知道GSH浓度，一般10mM,透析需要4度过夜。
3.一般是GST-A 要和beads 孵育1h,然后buffer wash，再加B蛋白孵育1h或者更久。全程4度。然后取每一步的样品run SDS PAGE。才能具体问题具体分析啊兄弟！
zxb597
有帮助
过分的裂解会使标签蛋白变性，阻止其结合。在裂解过程中，用温和的机械/化学裂解条件。标签蛋白的浓度过低，浓缩样品会提高结合。
隔壁家的小夜猫子
有帮助
可能是标签包起来了，可以尝试变性纯化
dxy_w4oj7yoe
有帮助
有三种可能：
1.诱导蛋白没有结合到GST beads上
2.wash的太过将诱导蛋白冲下来了
3.诱导蛋白性质不好沉淀在beads上了
先排除2 3再说1
证明2很简单，跑胶看一下wash里有没有诱导蛋白，如果有的话可以减少wash buffer体积
证明3的话只需要跑胶跑一下beads，看上面有没有目标蛋白
如果确定是没有结合的话，可能是结合buffer条件不合适，可以再试试不同的buffer，或者是透析等操作对蛋白性质影响较大，可以尝试浓缩置换buffer或者用分子筛置换buffer
dxy_pni5ki46
有帮助
有可能是gst融合蛋白洗脱时缓冲液中gsh没透析干净，导致gst结合不上，也可能是ph不对gst失活
提问
扫一扫
实验小助手
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序