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GSTpulldown诱饵蛋白不结合柱子怎么办?

相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

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丁香实验

用大肠杆菌表达了一个大肠杆菌的GST标签原核蛋白,载体是pGEX-6P-1,蛋白表达出来了,而且在上清,通过GSH纯化柱纯化过后浓度有大概2mg/ml的样子,挺明显的条带,然后用TBS透析了一晚,但是做GST-pull down(赛默飞官网买的试剂盒)发现诱饵流过的样品里有诱饵蛋白的条带,猎物流过的样品里有猎物的蛋白条带,但洗脱液什么都没有,这种情况是不是诱饵蛋白没有结合到柱子上?怎么解决?

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28 个回答

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小布丁瑶瑶

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可能是标签包起来了,可以尝试变性纯化
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dxyhsx123

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第一,柱子是否合适?第二,结合实践是否够长?第三,洗脱速度是否合适?
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z流沙z

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有可能是没有结合上,另外要确认是否构建成功和诱导表达,可以考虑换个标签试试,设置阳性和阴性对照
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JCorona

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可能的原因:1.使用的试剂有问题,结合不牢固,在清洗步骤被洗掉;2.特异性过强,导致洗脱液竞争力不够,无法洗脱 没有详细的操作步骤,无法给出解决方案,建议多参考大家提出的可能原因,具体问题具体分型,针对性地解决。
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内科小护士

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蛋白挂不住,出了填料失活之外,主要的是要注意上样的流速不要太快,尽可能慢点,快了结合不上。
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是小杨同学

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估计是诱饵蛋白没有结合上,可以看下是不是gsh导致的gst没有结合到
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lzy必有我师

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第一,换根柱子。 第二,确认带标签的蛋白表达成功。不过相比这条已经确认过了 第三,确认his标签正常,没有形成包涵体
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vae1476

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请问有没有设置阳性和阴性对照呢?通过对照可以判断有没有结合。
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医往情深丁香园

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可以考虑换根柱子,其次确认带标签的蛋白表达成功。不过相比这条已经确认过了,最后确认his标签正常,没有形成包涵体。可以用anti-his做个wb。“洗掉好多”是跑胶验证了嘛?
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ZZDX-YILILI

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1.两个流出液中都有蛋白,也并不能说明就没有结合,或许是你投入的两个蛋白量都比较多,结合达到类似饱和是程度,所以多余的就流出来了。 2.也许是真的没有结合,那样就需要摸索结合体系。 3.设置阳性和阴性对照,这样方便判断有没有真正结合。
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verbalkint

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很有可能是没结合到柱子上。把trash和flow through收集再过一遍gst的柱子,换一个新的。另外做个gst pulldown看看标签表达了没有
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dxy_qkedgrg7

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我们在用GST标签进行pulldown实验的时候也有挂不上柱子的,大概率是标签被折叠在了蛋白内部,需要从新构建载体。
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一支肾上腺素

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蛋白都是包涵体,这种情况最好先优化一下诱导条件,把诱导温度降下来,甚至可以16度诱导过夜,看看能不能提高蛋白的可溶性。蛋白挂不住,出了填料失活之外,主要的是要注意上样的流速不要太快,尽可能慢点,快了结合不上。
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dxy_bq4uxnd

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可能是GST标签被折叠在了蛋白内部,无法与柱子结合,这种情况可能需要调换GST标签的位置。
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dxy_h7vcp8v3

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如果两个蛋白都没有问题的话,可以增强蛋白与磁珠孵育结合的时间。其二检查是否试剂盒过期。其三增加蛋白浓度。其四检查是否孵育buffer的ph值使蛋白失活。
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jey1235

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描述没太看懂,提几点建议: 流穿有可能tag掉了,有可能GSH残留,有可能GST-protein 处理变性。 1.首先确认GST-beads能够binding到target protein,说明tag没问题。 2.GSH洗脱后需要透析,另外不知道GSH浓度,一般10mM,透析需要4度过夜。 3.一般是GST-A 要和beads 孵育1h,然后buffer wash,再加B蛋白孵育1h或者更久。全程4度。然后取每一步的样品run SDS PAGE。才能具体问题具体分析啊兄弟!
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zxb597

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过分的裂解会使标签蛋白变性,阻止其结合。在裂解过程中,用温和的机械/化学裂解条件。标签蛋白的浓度过低,浓缩样品会提高结合。
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隔壁家的小夜猫子

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可能是标签包起来了,可以尝试变性纯化
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dxy_w4oj7yoe

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有三种可能: 1.诱导蛋白没有结合到GST beads上 2.wash的太过将诱导蛋白冲下来了 3.诱导蛋白性质不好沉淀在beads上了 先排除2 3再说1 证明2很简单,跑胶看一下wash里有没有诱导蛋白,如果有的话可以减少wash buffer体积 证明3的话只需要跑胶跑一下beads,看上面有没有目标蛋白 如果确定是没有结合的话,可能是结合buffer条件不合适,可以再试试不同的buffer,或者是透析等操作对蛋白性质影响较大,可以尝试浓缩置换buffer或者用分子筛置换buffer
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dxy_pni5ki46

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有可能是gst融合蛋白洗脱时缓冲液中gsh没透析干净,导致gst结合不上,也可能是ph不对gst失活
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