丁香实验_LOGO
登录
提问
我要登录
|免费注册

加入loading buffer煮沸后整个变红?

相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

user-title

丁香实验

之前提出的蛋白加入loading buffer煮沸后变红,更换了其他的loading buffer还是一样的结果。后来试着拿这个上样,结果样本上飘的很厉害,沉不下来。这应该是提的蛋白质有问题,但是为什么会这样呢?怎么处理

wx-share
分享

31 个回答

user-title

小布丁瑶瑶

有帮助
可能是蛋白质酸性太强了,可以检测一下样品或ph值
user-title

dxyhsx123

有帮助
这个问题没遇到过,一直都是蓝色。如果出现变色,应该是缓冲液的PH或者一些离子引起的,建议更换缓冲液浓度或者种类。
user-title

内科小护士

有帮助
转膜,转膜时的温度,样品的浓度这些都是需要考虑的,严格控制转膜时的温度再加入loading buffer煮沸。
user-title

dxy_rlratyf3

有帮助
煮沸后变红应该是酸性让loading buffer中的溴酚蓝显色了,样本上飘可能是溶剂的问题,因为有人用无水乙醇溶解样品就出现过类似的问题,可以换成1x PBS再试试。
user-title

lzy必有我师

有帮助
步骤有不对吧!蛋白本身不会沉下去的,让它沉下去的是loading dye里的sucrose。重新配loading dye,按冷泉港protocol配,另外不要煮沸,95度煮5-10分钟即可
user-title

是小杨同学

有帮助
可能是蛋白质酸性太强了,可以检测一下样品或ph值
user-title

隔壁家的小夜猫子

有帮助
酸碱度的问题,太酸了怕沉淀,观察一下没沉淀就跑电泳就行,变性电泳不影响。有沉淀就溶不回来了啊,重新做样品之前调下PH值。
user-title

医往情深丁香园

有帮助
估计应该是转膜的步骤有问题,或者是转膜的时候温度没有控制好造成的。
user-title

JCorona

有帮助
确定是变红而不是变黄了吗?也可能是混色造成看似红色的原因哦。溴酚蓝在酸性条件下呈黄色,样本飘也可能是因为酸性对蛋白质的结构造成了损伤,甚至是使得蛋白质水解了。可以查一查是哪个环节引入了酸性条件,针对性地调整试验方案。
user-title

ZZDX-YILILI

有帮助
应该是你提取的蛋白质太酸了,导致loading buffer中含有溴酚蓝加进去相当于在酸性环境中所以显示红色。溴酚蓝在4.6的情况下就显示蓝色了。
user-title

水深先试浅

有帮助
我们是在提的时候就加了loading buffer,然后保存在-20,等上样的时候,再拿出来煮几分钟
user-title

verbalkint

有帮助
蛋白本身不会沉下去的,让它沉下去的是loading dye里的sucrose。重新配loading dye,按冷泉港protocol配,另外不要煮沸,95度煮5-10分钟即可
user-title

一支肾上腺素

有帮助
估计是上样步骤有错误,建议将各个样品稀释到某一固定浓度,加入loading buffer后,在沸水中煮3-5分钟,使蛋白充分变性,也可使用PCR仪95度加热5分钟。
user-title

dxy_qkedgrg7

有帮助
可能是蛋白提取有问题,看看提蛋白的试剂是否有问题,如果没有的话就是ph不对,ph过低会变成红的,可以用tris-hcl调一下ph
user-title

dxy_h7vcp8v3

有帮助
蛋白质煮沸,不是上样必须的步骤。如果蛋白没有问题的话,可以采用不煮沸直接跑胶。如果,怀疑不是loading的原因而是蛋白的原因,就重新纯化蛋白质。如果,样品沉不到胶孔,可能是loading里甘油浓度不够,还有可能是纯化的并非蛋白质样品,而且别的杂质。建议,先确实蛋白质是否纯化正确。
user-title

jey1235

有帮助
样品的pH有问题,建议查看样品的buffer或者是否有特殊试剂。可以直接加入SDS+DTT+glycerol 制备简单loading buffer。通过增加glycerol的比重可缓解上样飘的问题。另外样品根据是否需要native状态是否添加SDS和煮沸步骤。DTT是考虑是否打开二硫键。
user-title

zxb597

有帮助
可能loading buffer pH值偏离,可能转膜有问题,样品浓度。
user-title

dxy_pni5ki46

有帮助
不知道蛋白制备完是什么样子,我遇到过一次样品煮完变红是样品本身裂解完就有一点点红,加了loading buffer后蓝了一些,但是煮后变红,我推测是煮完ph偏酸性了溴酚蓝变黄色盖不住样品的红色了。我当时重新制备时用超滤管超滤了一下,洗了两遍,之后再制备的就正常了。我推测是样品中含有一些代谢产物的影响,我做的是肾脏。至于上不了样不知道样品煮完是否是粘稠有凝胶感,还是正常的样子,按正常有甘油就能沉下去,除非是样品中的什么物质和甘油反应?突然脑洞开了一下煮熟变红的不会是虾青素吧
user-title

小白野蛮成长

有帮助
我之前有一次变成黄色的 很纳闷 玄学
user-title

Guoood

有帮助
加入loading后变红,可否提供下图片?是不是正常提取细胞或组织的蛋白?我试过做coIP时用酸性洗脱,洗脱后忘了加碱性中和液,直接加入loading,结果直接变成深黄色。
  • 1
  • 2
  • 跳至
提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序