为什么做的 Western 最后都没有显出影啊？

张振1986

2013-04-04

最近开始做western，结果非常不理想，第一次做的时候，内参和目的基因均显示出来，就是内参不齐，打算再做几次验证一下，可是接下来做了3次什么都没显出来啊，现在非常郁闷啊，想请各位老师帮忙指点一下。我具体是这样操作的，目的蛋白55KD，内参36KD，上样量20ul，总分子质量大约为25ug。10%浓缩胶，4%分离胶，电泳80V 30min，100V 120min，转膜90V 100min，5%脱脂奶粉封闭1h，TBST5minx3次，一抗4c孵育过夜，TBST5minx3次，二抗室温孵育1h，显影。电泳过程中条带我看的很好，转膜我也感觉没有问题，现在不知道是什么原因啊，十分着急，请求指教。谢谢

10 个回答

左中右

2013-08-22

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第一次做出来了，系统应该没有问题，蛋白会不会降解，这几次的转膜效果怎么样？考马斯染一下试试吧！

张振1986

2013-08-14

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最佳答案应该分为以下几方面：1.蛋白是否降解？2.配胶问题3.上样前是否将蛋白充分溶解？4.切膜是否过度?

prime0711

2013-04-17

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如果你的实验条件都没变的话，有可能是蛋白反复冻融降解了，或者抗体失活。也有可能是显影定影剂放久了，一般有效期只有三个月，或者没有完全避光保持。至于你第一次做的内参不齐，考虑孵育抗体时没混匀，要让膜在密封袋里漂浮转动才行。

wangyx520

2013-04-17

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我觉得分离胶的浓度可以降点电泳时间没必要那么长啊

wuhao88

2013-04-10

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在两个实验室遇到过ECL试剂盒出问题，第一次是前人用试剂盒时吸取液体没有换枪头，试剂盒污染；第二次是师兄用下来的试剂盒，开封日期已经2年，最后验证是试剂盒失效，换了试剂盒之后就曝出很漂亮的条带，浪费了我半个月时间。
我遇到同样的问题是从头找起的：先用考马斯亮蓝染胶看看胶上有没有蛋白，排除蛋白被降解，如果没有问题，再用考马斯亮蓝染转膜后的膜，可以看到膜上是不是有蛋白，如果还没有问题，就要注意二抗是不是和一抗吻合的，二抗要用HRP标记的，这还没有问题的话，换个ECL试剂盒试试吧，如果涂ECL之后能看到条带的话说明前面都没有问题，最后的问题可能是胶片曝光了，显影液、定影液出问题了。

zerg2_1

2013-04-10

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10%浓缩胶，4%分离胶，电泳80V30min，100V 120min.4%的胶跑这么长时间，估计蛋白都跑没了吧。建议你1：转完膜用丽春红或者快绿染色看一下蛋白有没有转过去。2：跑完的胶蓝染，看有没有条带。

alaling

2013-04-09

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在做western的时候，有一步的“质控”非常重要，就是转膜后的丽春红染色。这一步能鉴定你的蛋白是否已经转在膜上了。如果丽春红染色有条带，说明是后续的抗体杂交或者曝光的问题，如果丽春红染色都没有条带，说明问题出现在转膜之前的步骤，如蛋白样本出现问题、跑胶出现问题、转膜出现问题等。另外，做实验要弄清楚每一步的原理，你说“电泳过程中条带我看的很好，转膜我也感觉没有问题”，应该都是没有道理，而只是你的直觉的，想要真正找到原因，要一步一步来排查的。另外如果一点都没显影的话，应该不是牛奶浓度的问题，也应该不是抗体浓度的问题，这些只会影响你的显影质量而不会影响你是否出条带。

sanemind

2013-04-08

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有可能是你的蛋白不新鲜可能时间久了被降解了或者是换用抗体了，一抗或二抗抗体的质量也很重要

雨露飞扬

2013-04-08

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亲，会不会是封闭过度了呢？5%mlik可能会比较高，换成3%试试吧，我曾经就有因为封闭过度而导致没有条带

cqc0809

2013-04-08

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因为影响WB的因素有很多，据你描述我估计问题出在以下几个方面：1.更换转膜液，转膜液是有保质期的，配置好后超过2周使用即可失效，最好使用新鲜配制的转膜液。2.转膜的问题，因为你的两个目的条带比较接近，可能是切胶过程中将其切走，marker也存在误差。3.抗体孵育的问题，因为是两种蛋白分别孵育，就可能会出现错误，建议一个个来，先做内参。