为什么同一批次提取蛋白跑出的条带不一致？

相关实验：蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)

chengxue727

2013-02-27

做这个实验的时，我同一批次提取的蛋白，胶跑出的条带都不一致，这是什么原因呢？

25 个回答

notsmartxiaoyi

2020-02-23

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可能与以下几点相关：1、尽可能保证系统一致，包括试剂，液体，仪器；2、操作者的熟练程度；3、蛋白反复冻融降解。

香OTFK

2018-08-09

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可能涉及几个原因：1，拔梳子时胶错动，加入样本后渗入其他孔或漏出。因为内参表达高，可能不会显示出差异。2，加入样本时不均匀也可能会产生误差。3，制胶应保证均匀无气泡，玻璃板干净，这样才能保证结果一致可靠。

dxy_j6u055yr

2018-05-09

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可能你的目的蛋白易分解，上样前蛋白是否混匀，实验中样品有没有置于冰上。

yanghai-suda

2018-03-18

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ECL发光液没有铺均匀，不一致的条带旁边是否有保护孔，这两个因素都有可能影响条带。

中科联盟

2017-12-11

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可能你的目的蛋白易分解，上样前蛋白是否混匀，实验中样品有没有置于冰上。

应用场景

2017-10-15

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如果实验经常出现这种问题，可能就是您该换荧光二抗的时候了[微笑]如果参考LI-COR Odyssey的建议，您首先要确保内参的可靠性，其次，需要确保成像系统没有过曝（内参由于丰富高，一般的ECL成像非常容易过曝），因为过曝后的数据不具备参考性。

钉豆钉

2016-01-25

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最终的曝光步骤也挺关键的，压片的力度均匀度，时间，以及ECL的残留都会对条带有影响，

总有二狗想咬朕

2015-12-30

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1.你蛋白的问题，虽然是同一批的，但是可能在蛋白表达与纯化过程中难免会出现个别的异类；2.你的操作流程，不管做什么都会有误差，不可能每次的做的都一样，我们只能减少误差，所以可能你觉得自己每次都做得一样，但是可能某个小细节你并没有发现；3.试剂，也许你的试剂已经不能用了，或者溶度不对了都会影响你的实验。做一个实验来说唯一原则就是精准，也许你这次做出来了下次就做不出来了，每次做的时候写下来，不要嫌麻烦，这样做错了能省很多时间。

无名冷雨

2015-12-25

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这个问题我以前在做western blotting的时候也遇见过，楼主说是内参一致，而目的条带每次都不一样，我想说原因可能是在显影液环节，简单来说就是你的膜没有淋干净，上面残留参差不齐的T/TBS，T/TBS能稀释显影液，目的条带本来表达量就少，某一个点残留的T/TBS稍微多一点就可能导致显影效果下降，所以建议在显影液反应前，尽量将膜上的洗膜液淋掉（当然也不能让膜干了，要是实验室富裕的话，也可以多添点显影液，效果一样），希望对你有帮助。

momo琳

2015-10-12

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我也出现这种情况，我做的是组织蛋白更不稳定，内参跑的很漂亮但是目的条带只能呵呵了，我个人觉得因为内参蛋白本身比较稳定而且内参抗体也很成熟所以相对出结果比较好看，而目的抗体就不一样了，样本之间的差别还有抗体的问题（如一二抗特异性，浓度等），光是这两个因素就够做好一阵子了，只能不断摸索了。

咸蛋超人不会飞

2015-04-08

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我感觉应该是付抗体不匀，再就是曝光液要加均匀

好学小王子

2014-09-11

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我觉得主要是一抗孵育不均匀造成的，其次就电泳液、电转液用新配的，不要用重复利用的，电泳液，电转液中的离子浓度也会影响效果

尼克酰胺腺嘌呤二

2013-08-22

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如果没有操作问题的话，此种情况最有可能是目的蛋白抗体孵育不均或者发光液不均匀造成的

临涧

2013-08-21

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就个人经验,虽然用WB做出一张满意的结果涉及多个环节,但向上面你提到的内参没有问题,说明各项操作基本是过关的,据我猜测很可能是最后一步曝光出现的问题,加发光液反应的时间及曝光的时间都会对最后的结果产生影响, 还有一种可能你的发光液的稳定性也许不太好,希望对你有所帮助,哪里说的不对也请多指教.

dxymuchong

2013-08-21

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我可以这么理解吗：内参稳定说明上样量稳定（应该大致是一样的），所以不存在什么上样量不一样的问题；出现这样的结果，问题出在每一步都有一定的可能性，比如电泳，转膜，敷抗体，显色等等。但据我所知，WB最关键的还是转膜和敷抗体步骤，可能是你敷抗体的时候敷的不均匀。我的建议是你再认认真真，仔仔细细做几遍，很可能重复性就做出来了。只是个人观点。

钟建军

2013-08-19

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你们上面说的也太大了吧，实际点啊！我建议多加点发光液或者是显色液，然后不要用东西去上面擀，多等一会儿，在荧光最强时甩掉显色液，在压片！

200210lee

2013-08-19

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楼主最好上图，看下条带情况。听口气楼主应该是老手了，基本操作的问题我们没必要去考虑。我认为问题的关键在于成像的过程。同一张膜，本人可以在成像的时候，做出完全不同的图片结果。显色液的滴加，量，以及曝光时间，条带颜色（要求灰色而不是黑色）。所以最好有图片说明问题。

wjx98801

2013-08-19

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影响因素太多了，我觉得关键1：上样时注意气泡问题，保证上样量一样。2：孵一抗是否均匀

liannianyouyu82

2013-08-17

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影响因素比较多的，样品是否反复冻融，加样枪的误差也可能的。

dc1121

2013-08-16

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内参基本是稳定整齐的，这个话本来就不准确了，内参是用来校正的，western过程中很多步骤，从测蛋白浓度，煮蛋白，做胶，上样，电泳，转膜，最后的曝光，曝光液的滴加以及反应时间长短，都会影响到最后的结果。所以western定量的话也只能仁者见仁智者见智了，特别是做不同剂量组的趋势。

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