Nicine
这几天在做circRNA的R nase R消化实验,有没有大佬可以告诉下小窍门。。做了好几次都把目的circRNA消化没了,用的是碧云天的产品,源基因表达大概在24,circRNA表达大概在26附近。
dxyc42u
很有可能是rna提的不够纯导致的
土井挞克树
RNase R消化一般于37℃进行反应,时间10-30 min为宜(Memczak S et al., 2013; Legnini I et al., 2017),不推荐过长时间的消化。另外检测不同的基因可能也需要摸索反应时间,笔者实验室直接用于RT-PCR检测时常用5-15 min消化就能得到很好的结果,线性基因丰度可以降低几十到几百倍,circRNA丰度则基本不变。
经RNase R消化后直接进行逆转录反应的,推荐在37℃反应结束后保持70℃ 10 min使RNase R灭活(Cheng ZF et al., 2002)。如果消化后要进行纯化回收,也可以不做酶的失活。
loveliufudan
在处理CirCRNA(环状RNA)的RNase R消化实验时,确保操作的准确性是非常关键的。以下是一些可能有帮助的窍门和建议:
1. 反应时间和温度:RNase R的反应时间和温度是非常关键的参数,需要根据你的样本和实验设计进行调整。过长的反应时间或过高的温度可能会导致过度消化,包括目标CirCRNA。
2. 酶的量:确保你正在使用正确的RNase R量。使用过量的酶可能导致目标RNA被消化。
3. RNA的纯度和完整性:在RNase R处理之前,确保你的RNA样本是纯净和完整的。RNA样本中的蛋白质、脱氧核糖核酸(DNA)或其他杂质可能影响RNase R的活性。
4. 样本量:在RNase R消化实验中,输入的RNA量可能会影响消化效率。你可能需要优化你的实验条件以确保你有足够的RNA进行后续的分析。
5. DNase处理:在RNase R处理之前,进行DNase处理以去除可能存在的DNA杂质。
6. 消化后清洗:消化后要彻底清洗,否则可能会有RNase R残留,影响后续PCR实验。
7. 验证CirCRNA:可以使用Northern blot或其他方法验证CirCRNA的存在,此外也可以设计跨过回接处的引物进行PCR以验证CirCRNA的存在。
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