求助QPCR扩增曲线和熔解曲线起点高的问题！
正暖
各位老师，同学，打扰啦，qpcr小白做了两波pcr，出现了以下问题，但不知道出错原因在哪儿，还望各位不吝赐教[合十][合十][合十]
提取的rna A260/280数值正常，逆转录时因不熟悉用量，用了试剂盒允许的最大rna剂量2ug.之后使用原液0.8ul和上下游引物各0.4ul配置20ul体系进行扩增，但扩增曲线起点高，熔解曲线也是起点高，下降后出现单峰。今天对原液进行了浓度梯度稀释检测，也是这样的状态。图片如下。烦请各位指点迷津[抱拳][抱拳][抱拳]
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3 个回答
Dr_劉医生
有帮助
起点过高，可能是由于软件在进行基线自动扣除的时候出现错误，引起了扩增曲线抬升。建议手动调整基线，即可正常
whilt-shirt
有帮助
有可能是试剂的原因，建议安装试剂说明书重新设定程序
毛利小五郎的徒弟
有帮助
检查一下你所用的酶是否为化学修饰的热启动酶，预变性时间至少 5 min，如果是高 GC 的模板，可以延长预变性时间至 10 min，预变性时间不够，会导致酶活未完全释放，酶活释放不好，那扩增效率肯定就不行啦
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