如何设计上下游引物引物，然后提质粒，并把目的基因转染到质粒里?

根据你目的基因的序列设计引物然后扩增，通过酶切连接，合成重组质粒

你的步骤错了，1，首先确定要克隆的片段，2，确定要插入的载体，及酶切位点，3，设计引物包含克隆片段及酶切位点及载体的一部分。4 pcr 扩增，5，酶切，6 连接，7，转化。

用软件比如oligo设计引物，先把质粒酶切，引物高温退火之后与引物按比例连接，产物跑胶回收，转化