为什么有一个基因，换了好几个高保真酶，也用了二步PCR（先45℃退火10个循环，再55℃退火25个循环）还是完全没有条带呀

有可能是引物问题，建议重新设计引物

跟酶关系不大，你引物是怎么设计的？首先确定引物没有问题，然后用普通的taq酶加你的引物，直接pcr试试，如果能出来，说明引物没有问题，然后再用高保真的酶进行pcr

引物设计没问题吧，可以试一试touchdownpcr循环。

PCR没有条带可能的原因及对应的解决方案如下：

　　 模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成 DNA 脱嘌呤而影响 PCR 的结果。

　　 变性温度是否准确：PCR 仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

　　 反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加 Taq 酶以前，将反应体系 95℃ 加热 5~10 分钟。

　　 引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。

　　 引物错误。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。

　　 DNA 凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是 DNA 凝胶和 PCR 程序的问题。