PCR 扩增产物于引物区会发生移码突变吗？

赵栋2012

2013-02-28

设计引物扩增目的片断，上游引物序列为：GGCCCAGCCGGCC;ATGGTGTTAAGTCTTCTGTA（空格前为酶切位点），扩增产物与 T 载体连，测序正确，但峰形不好，即在 GTT 之间有个大 C 峰，之后酶切与另一载体连接，测序总是在 ATGGTG 后多了一个 G，这是引物的问题，导致 PCR 扩增时发生突变？还是引物合成的问题？或者是酶切，换载体时发生的突变？

1 个回答

tao0129

2013-02-28

有帮助

一般来说测序在最开始的20个碱基是不太会有好的峰型的，但是如果你几次测序都是这个结果，那么就应该是引物合成的问题了。一般生工默认的合成引物会有三种纯化方式，PAGE胶纯化，过柱子和HPLC，三种的价格是PAGE<柱子<HPLC，一般默认好像是PAGE胶纯化，但这种方式纯化的引物不是很纯，所以适合做RT引物，如果你要做克隆，最好还是选择HPLC纯化的，当然PAGE在不出意外的时候也是可以的。
另外，你的酶切位点与突变的位点不在一个位置，所以由于酶切造成的可能性不是很大，但也不能排除这个原因。