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PCR 扩增产物于引物区会发生移码突变吗?

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赵栋2012

设计引物扩增目的片断,上游引物序列为:GGCCCAGCCGGCC;ATGGTGTTAAGTCTTCTGTA(空格前为酶切位点),扩增产物与 T 载体连,测序正确,但峰形不好,即在 GTT 之间有个大 C 峰,之后酶切与另一载体连接,测序总是在 ATGGTG 后多了一个 G,这是引物的问题,导致 PCR 扩增时发生突变?还是引物合成的问题?或者是酶切,换载体时发生的突变?
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1 个回答

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tao0129

有帮助
一般来说测序在最开始的20个碱基是不太会有好的峰型的,但是如果你几次测序都是这个结果,那么就应该是引物合成的问题了。一般生工默认的合成引物会有三种纯化方式,PAGE胶纯化,过柱子和HPLC,三种的价格是PAGE<柱子<HPLC,一般默认好像是PAGE胶纯化,但这种方式纯化的引物不是很纯,所以适合做RT引物,如果你要做克隆,最好还是选择HPLC纯化的,当然PAGE在不出意外的时候也是可以的。
另外,你的酶切位点与突变的位点不在一个位置,所以由于酶切造成的可能性不是很大,但也不能排除这个原因。
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