southern blot转膜的速度和时间怎么把握

Southern blot转膜的速度和时间需要根据具体实验情况和转膜装置进行调整。以下是常见的建议和注意事项：

转膜速度：转膜速度应该适中，不要过快也不要过慢。过快可能导致样品在膜上分布不均，过慢则可能导致Western转膜液不足，影响转移效果。通常建议转膜速度为10-20毫升/分钟。

转膜时间：转膜时间也需要根据实验情况和转膜装置进行调整。通常建议转膜时间为1-2小时，但具体时间可能因实验所需而异。转膜时间太短可能导致样品未能完全转移到膜上，转膜时间太长则可能导致样品在膜上过度扩散，影响检测灵敏度。

Western转膜液吸取：Western转膜液的吸取速度和量需要控制好，避免过快或过多，导致样品分布不均或者Western转膜液溢出。如果吸取太快，可以尝试将吸取速度降低或者在Western转膜液中加入一定量的稳定剂。

转膜装置：不同的转膜装置对于转膜速度和时间有不同的要求，需要根据装置说明书进行操作。

转膜

1、将胶裁成9.8cm×8.0cm 大小，于平皿中用蒸馏水冲洗一次；（此步一定记好胶的大小，后面裁纸/膜以及杂交液体积的选择都要用到）

2、加入100ml 0.25 mol/L 的盐酸脱嘌呤，室温振荡15~30 min，至溴酚蓝完全变成黄色。（如果限制性片段＞10kb，酸处理时间可适当延长；若限制性片段很小，此步可省略）

3、用蒸馏水冲洗2 次。加入变性液（1.5mol/L NaCl、0.5mol/L NaOH）室温振荡20~30min；至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色。

4、用蒸馏水冲洗2 次。加入中和液（1.5mol/L NaCl、1.0mol/L Tris-Cl ， pH7.4）室温振荡2×15min；

5、用蒸馏水冲洗2 次。加入2×SSC 平衡凝胶和尼龙膜 5min；

6、虹吸印记法转膜26 小时

1) 在方盘上放置一平板，其上放置一滤纸，滤纸两端搭入盘内浸入2×SSC中，用玻璃棒赶走滤纸和平板之间的气泡。

2) 将凝胶倒置于平台上, 正面朝下，切掉右下角，并用保鲜膜封闭四周以防止吸水纸接触凝胶的边缘从而接触平板造成液流的短路。

3) 将尼龙膜放于胶上，赶走气泡。

4) 膜上放两张滤纸，其上再放20层吸水纸。

5) 吸水纸上放一平板，其上放500g左右的重物，目的是建立液体从液池经凝胶向尼龙膜的上行通路，以洗脱凝胶中的DNA 并使其聚集到尼龙膜上。

6) 室温下过夜转膜，持续16小时以上，期间换纸2-3次。

7）完成转膜后，胶染色，观察转膜效果。并标记好序号、加样孔位置和对应分子量标准的位置，尼龙膜和凝胶直接接触的一面为正面。

8）用2×SSC漂洗尼龙膜一次，滤纸吸干，紫外交联仪下照射固定DNA(5000μJ /cm2)5min。

转膜时间需要根据目的分子量的大小进行调整，建议根据实验要求进行摸索，若是转膜不彻底适当延长转膜时间，也可通过胶、膜和滤纸上的条带进行预判。

Southern blot转膜时，转膜的速度和时间对转移效率和质量都有很大的影响，因此需要谨慎把握。以下是一些常用的建议：

Western转膜液的吸取速度：Western转膜液的吸取速度应该缓慢均匀，以避免造成滤纸和膜的破损。建议在转膜过程中要注意控制压力，不要用力挤压滤纸和膜，也不要使Western转膜液过多，避免造成压力差。

转膜时间：转膜时间一般在1-2小时之间，具体时间根据实验需求和条件而定。如果转膜时间太长，会导致DNA在膜上的扩散和模糊，影响杂交效率；如果时间太短，则可能会造成转移不完全。建议进行一定的试验和优化，以找到最佳转膜时间。

吸水纸的更换：在转膜过程中，吸水纸的更换也很重要。当吸水纸变湿时，Western转膜液吸取速度会变慢，影响转移效率。因此，建议在转膜过程中及时更换湿润的吸水纸，以确保吸水纸始终保持干燥状态。

总的来说，转膜时需要细心仔细，避免造成滤纸和膜的破损，控制好吸取速度和转膜时间，及时更换吸水纸，以获得高质量的转移效果。