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请问大家都是怎么提乳鼠的原代肝细胞呀,有具体的实验步骤吗,我提的不贴壁,到底原代肝细胞是否贴壁呢?

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dxy_yytamw7e

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4 个回答

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huarenqiang5

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估计是你的操作步骤问题。原代肝细胞很容易贴壁生长,4小时一般都能贴壁。

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dxy_yytamw7euser-title

你好,我想问你下您可以给我发一下具体的步骤吗,我们提的是乳鼠的原代肝细胞,就是刚出生没几天的鼠?

还有我们其实提出来贴壁了很快但是第二天就都飘起来了?想问一下你们也是用1640培养吗,多大浓度的血清呢,不好意思只有一次提问机会了,问的比较多一些,谢谢🙏

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loveliufudan

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提取原代肝细胞通常涉及以下步骤:

1. 准备工作:消毒实验台、培养器具、培养液等。

2. 预备解剖材料:从小鼠提取肝脏,通常在麻醉状态下进行。

3. 肝脏处理:将肝脏迅速移至培养皿中,用生理盐水轻轻清洗去除血液。

4. 组织分离:将肝脏组织切碎,可以选择用剪刀或组织研磨器进行处理。

5. 细胞分离:用消化酶(如胰酶、胆酸盐等)进行细胞分离,通常在37°C下进行适当的消化时间。

6. 细胞收集:停止消化酶的作用,加入培养液进行细胞收集。

7. 细胞筛选:通过离心或滤网筛选细胞,去除细胞碎片和大颗粒物。

8. 细胞计数:用显微镜和细胞计数仪等工具对细胞进行计数。

9. 细胞培养:将原代肝细胞分散在培养皿中,加入适当的培养基和补充物,维持细胞的生长和功能。

原代肝细胞在培养中的行为可能会有所不同。通常,初期培养的细胞会在培养皿上贴附并逐渐形成单层细胞。然而,原代肝细胞的贴壁性不如某些细胞系那么强,有些细胞可能会以浮游状态存在。因此,在培养原代肝细胞时,通常会选择适当的培养基和培养条件,以促进细胞的贴壁和维持其生长和功能。

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毛利小五郎的徒弟

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具体步骤:

一、实验动物:


ICR,4-6W


二、实验器材:


手术剪、手术镊、玻璃皿、泵、注射器、一次性静脉输液器


三、实验步骤:


1、先注射0.5ml肝素钠,再注射0.3ml 15%水合氯醛,将小鼠麻醉,同时防止凝血。


2、酒精消毒,用手术剪剪开小鼠皮肤,暴露腹腔,可见鲜红的肝脏,将肠挪到右侧,胰腺也挪到右侧,暴露出下方静脉血管(门静脉),再找到中间偏左腹腔静脉(下腔静脉)。


3、右手取静脉注射针平插入门静脉远端,左手用镊子夹住针头及血管,防止其脱落,右手轻轻的松开,左手保持不动,启动泵,开始导入预热至37度的无钙灌流液(G2),待充盈立起来(有的肝不明显),右手持手术剪剪断下腔静脉,放流,使血液和灌流液流出。可观察到肝叶垂下来,然后右手持镊子夹住下腔静脉,停止放流。慢慢地,肝叶又充盈立起来,待肝叶完全立起来后,右手的镊子松开,放流,这个过程不断循环,一般需要灌50-60ml。可观察到肝叶逐渐肿胀变为淡黄色,肝叶立起来的现象渐渐不明显。


4、待下腔静脉流出液接近无钙灌流液,用注射器吸取5-6ml胶原酶1稀释液(G3),接入灌肝装置,慢慢推入,尽量控制五分钟左右推完。整个期间,左手镊子一直夹住静脉插针和血管,不能松开而使静脉针脱落。(此过程需要另一个人协助完成)


5、肉眼观察到肝叶表面出现渗出、肝包膜下组织呈龟背状裂隙、组织呈弥散状时判断肝脏已被消化充分,可以终止灌流 。


6、小心剪下整个肝,放入含有基础培养基的玻璃皿内,过程要慢,轻柔。从肝叶中间轻轻撕开轻甩一下,能观察到有肝细胞掉下来。


7、吸取少量液体,台盼蓝染色,在显微镜下观察肝细胞状态及数量。


8、加入DF-12完全培养基终止胶原酶消化,用镊子撕开肝组织,轻甩,吸取液体,300r/min,5min。


9、接种,DF-12,双抗,密度控制好。

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sswei

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实验步骤

1麻醉小鼠,酒精消毒,暴露腹腔,带线缝合针从下腔静脉下穿过,打一松松的假结,从假结下方的静脉插入静脉留置针,将假结系紧。

注意:穿带线缝合针时不要扎破血管,打的结不要包进太多肉,否则结系不紧。静脉留置针如成功扎进血管,里面的针拔出来时会出现回血现象。

2通过留置针注入肝素1ml后 (快速推注),准备给予灌流液1,同时剪开肝门静脉,灌注时间3-5min。

3.30ml灌注液2灌流3-6min(灌注时间很重要,两次灌注时严格保持针不要动,否则容易扎破血管)。翻开肝脏取出胆囊。

4摘下肝脏放入置于冰上的平皿中,将肝脏转移至细胞间内,放于400目筛网上,用4度预冷的1640无血清培养液反复吹打肝脏,并用灭菌的镊子摔打(不要太用力),将肝细胞吹打下来,直至剩下肝包膜(注意肝脏不能摩擦筛网)。取20 μl细胞液观察细胞活力。加入2 μl台盼蓝染色(0.4%)染色涂片,混匀盖上玻璃片,显微镜下观察。

5静置5 min将细胞沉淀(将皿倾斜放置),用枪小心吸弃部分上清。

6将沉淀的肝细胞转移到50 ml离心管中,补齐无血清预冷1640至25 ml。4度50 g离心2分钟,一共离心三次,离心后弃上清。

7用6 ml含10%血清的1640培养液重悬细胞,铺细胞于培养皿中,因细胞沉降快,每次铺前都要吹打混匀,2 h-6 h细胞贴壁。6 h换液给予处理。(6孔板每孔大约分106个细胞)

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