请问大家都是怎么提乳鼠的原代肝细胞呀，有具体的实验步骤吗,我提的不贴壁，到底原代肝细胞是否贴壁呢？

估计是你的操作步骤问题。原代肝细胞很容易贴壁生长，4小时一般都能贴壁。

提取原代肝细胞通常涉及以下步骤：

1. 准备工作：消毒实验台、培养器具、培养液等。

2. 预备解剖材料：从小鼠提取肝脏，通常在麻醉状态下进行。

3. 肝脏处理：将肝脏迅速移至培养皿中，用生理盐水轻轻清洗去除血液。

4. 组织分离：将肝脏组织切碎，可以选择用剪刀或组织研磨器进行处理。

5. 细胞分离：用消化酶（如胰酶、胆酸盐等）进行细胞分离，通常在37°C下进行适当的消化时间。

6. 细胞收集：停止消化酶的作用，加入培养液进行细胞收集。

7. 细胞筛选：通过离心或滤网筛选细胞，去除细胞碎片和大颗粒物。

8. 细胞计数：用显微镜和细胞计数仪等工具对细胞进行计数。

9. 细胞培养：将原代肝细胞分散在培养皿中，加入适当的培养基和补充物，维持细胞的生长和功能。

原代肝细胞在培养中的行为可能会有所不同。通常，初期培养的细胞会在培养皿上贴附并逐渐形成单层细胞。然而，原代肝细胞的贴壁性不如某些细胞系那么强，有些细胞可能会以浮游状态存在。因此，在培养原代肝细胞时，通常会选择适当的培养基和培养条件，以促进细胞的贴壁和维持其生长和功能。

具体步骤：

一、实验动物：

ICR，4-6W

二、实验器材：

手术剪、手术镊、玻璃皿、泵、注射器、一次性静脉输液器

三、实验步骤：

1、先注射0.5ml肝素钠，再注射0.3ml 15%水合氯醛，将小鼠麻醉，同时防止凝血。

2、酒精消毒，用手术剪剪开小鼠皮肤，暴露腹腔，可见鲜红的肝脏，将肠挪到右侧，胰腺也挪到右侧，暴露出下方静脉血管（门静脉），再找到中间偏左腹腔静脉（下腔静脉）。

3、右手取静脉注射针平插入门静脉远端，左手用镊子夹住针头及血管，防止其脱落，右手轻轻的松开，左手保持不动，启动泵，开始导入预热至37度的无钙灌流液（G2），待充盈立起来（有的肝不明显），右手持手术剪剪断下腔静脉，放流，使血液和灌流液流出。可观察到肝叶垂下来，然后右手持镊子夹住下腔静脉，停止放流。慢慢地，肝叶又充盈立起来，待肝叶完全立起来后，右手的镊子松开，放流，这个过程不断循环，一般需要灌50-60ml。可观察到肝叶逐渐肿胀变为淡黄色，肝叶立起来的现象渐渐不明显。

4、待下腔静脉流出液接近无钙灌流液，用注射器吸取5-6ml胶原酶1稀释液（G3），接入灌肝装置，慢慢推入，尽量控制五分钟左右推完。整个期间，左手镊子一直夹住静脉插针和血管，不能松开而使静脉针脱落。（此过程需要另一个人协助完成）

5、肉眼观察到肝叶表面出现渗出、肝包膜下组织呈龟背状裂隙、组织呈弥散状时判断肝脏已被消化充分，可以终止灌流 。

6、小心剪下整个肝，放入含有基础培养基的玻璃皿内，过程要慢，轻柔。从肝叶中间轻轻撕开轻甩一下，能观察到有肝细胞掉下来。

7、吸取少量液体，台盼蓝染色，在显微镜下观察肝细胞状态及数量。

8、加入DF-12完全培养基终止胶原酶消化，用镊子撕开肝组织，轻甩，吸取液体，300r/min，5min。

9、接种，DF-12，双抗，密度控制好。

实验步骤

1麻醉小鼠，酒精消毒，暴露腹腔，带线缝合针从下腔静脉下穿过，打一松松的假结，从假结下方的静脉插入静脉留置针，将假结系紧。

注意：穿带线缝合针时不要扎破血管，打的结不要包进太多肉，否则结系不紧。静脉留置针如成功扎进血管，里面的针拔出来时会出现回血现象。

2通过留置针注入肝素1ml后 (快速推注)，准备给予灌流液1，同时剪开肝门静脉，灌注时间3-5min。

3.30ml灌注液2灌流3-6min（灌注时间很重要，两次灌注时严格保持针不要动，否则容易扎破血管）。翻开肝脏取出胆囊。

4摘下肝脏放入置于冰上的平皿中，将肝脏转移至细胞间内，放于400目筛网上，用4度预冷的1640无血清培养液反复吹打肝脏，并用灭菌的镊子摔打（不要太用力），将肝细胞吹打下来，直至剩下肝包膜（注意肝脏不能摩擦筛网）。取20 μl细胞液观察细胞活力。加入2 μl台盼蓝染色（0.4%）染色涂片，混匀盖上玻璃片，显微镜下观察。

5静置5 min将细胞沉淀（将皿倾斜放置），用枪小心吸弃部分上清。

6将沉淀的肝细胞转移到50 ml离心管中，补齐无血清预冷1640至25 ml。4度50 g离心2分钟，一共离心三次，离心后弃上清。

7用6 ml含10%血清的1640培养液重悬细胞，铺细胞于培养皿中，因细胞沉降快,每次铺前都要吹打混匀，2 h-6 h细胞贴壁。6 h换液给予处理。（6孔板每孔大约分106个细胞）