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构建载体菌落PCR有目的条带,送测测序结果为无信号或信号极弱是什么原因?

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穆子杉珊


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3 个回答

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毛利小五郎的徒弟

有帮助

可能存在杂质污染,显示的是杂质条带。

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loveliufudan

有帮助

可能有以下几个原因:

质量问题:PCR反应需要高质量的DNA作为模板。如果DNA质量不好,比如受到污染或降解,就会导致PCR反应失败或信号极弱。在构建载体菌落PCR时,如果DNA质量不好,可能是由于提取DNA的方法不当或者菌落中的DNA降解。

反应条件问题:PCR反应需要一定的反应条件,如反应时间、温度、酶浓度和引物浓度等。如果反应条件不够理想或不准确,PCR反应也会失败或信号极弱。

引物设计问题:PCR引物是PCR反应的关键。如果引物设计不合理,比如引物太短、太长、含有二聚体、引物浓度不足等,就会导致PCR反应失败或信号极弱。

目标DNA浓度问题:PCR反应需要一定的目标DNA浓度才能产生可靠的PCR信号。如果目标DNA浓度太低,就会导致PCR反应失败或信号极弱。

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sswei

有帮助

1,外部原因包括:

(1)实验员的操作原因

样品污染、样品用错、引物加错、BDT漏加、试剂的使用量错误、回收错误等操作过程的错误

(2)仪器的原因

(3)实验条件的原因

实验过程中的温度和湿度,退火温度的不合适

2,内部原因包括:

(1)菌液和质粒

原因:测序模板与引物无法配对,或者配对能力较差,造成测序信号弱甚至无信号。

分析:菌液浓度太低甚至失活,或者载体为低拷贝,造成提取的质粒浓度低,测序无法产生足够信号;载体的信息错误,或者载体经过改造,测序引物与模板无法有效结合,造成测序无信号;客户提供的质粒浓度太低,质量太低造成测序无信号;引物发生降解导致测序无信号;引物定量不准造成测序无信号(引物与模板比例差异较大);无插入片段。

(2)PCR切胶和已纯化

原因:测序模板与引物无法配对,或者配对能力较差,造成测序信号弱甚至无信号。

分析:测序引物与模板没有结合位点;测序引物或者模板,已经发生降解;样品浓度太低,造成纯化之后的模板浓度太低,测序无法产生足够信号;PCR产物送样量太少,造成DNA总量太少,纯化之后无法产生足够模板,测序信号弱,甚至无信号;PCR片段大于2000bp时,纯化效率显著降低,造成模板浓度不足,测序信号偏弱(作出这个判定时要根据已经回收后的产物电泳亮度才行)

(3)引物:

自备引物太长造成自连或walking引物有较重的引物二聚体、错配(错配会导致多个结合位点,出现双峰,不是无信号)、发卡结构等造成测序无信号;引物浓度太低或者太高都可能造成测序无信号;引物发生降解或者被污染造成测序无信号;简并引物、引物过长、引物不纯等导致测序无信号。

(4)其他

困难模板,样品在前端存在高级结构,引物结合上去之后无法继续测通;Buffer种类的不合适;PCR模板(PCR已纯化和质粒是客户自己提供的,如果模板溶于TE会导致信号衰竭,无信号,各种乱峰,是因为TE溶液里的EDTA导致,我们把模板重新洗脱即可重新测序)含有抑制物导致产量低导致无信号;PCR(引物退火,不是PCR)退火温度太高,延伸时间太短导致无扩增产物而导致测序无信号。

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