构建载体菌落PCR有目的条带，送测测序结果为无信号或信号极弱是什么原因？

可能存在杂质污染，显示的是杂质条带。

可能有以下几个原因：

质量问题：PCR反应需要高质量的DNA作为模板。如果DNA质量不好，比如受到污染或降解，就会导致PCR反应失败或信号极弱。在构建载体菌落PCR时，如果DNA质量不好，可能是由于提取DNA的方法不当或者菌落中的DNA降解。

反应条件问题：PCR反应需要一定的反应条件，如反应时间、温度、酶浓度和引物浓度等。如果反应条件不够理想或不准确，PCR反应也会失败或信号极弱。

引物设计问题：PCR引物是PCR反应的关键。如果引物设计不合理，比如引物太短、太长、含有二聚体、引物浓度不足等，就会导致PCR反应失败或信号极弱。

目标DNA浓度问题：PCR反应需要一定的目标DNA浓度才能产生可靠的PCR信号。如果目标DNA浓度太低，就会导致PCR反应失败或信号极弱。

1,外部原因包括：

（1）实验员的操作原因

样品污染、样品用错、引物加错、BDT漏加、试剂的使用量错误、回收错误等操作过程的错误

（2）仪器的原因

（3）实验条件的原因

实验过程中的温度和湿度，退火温度的不合适

2,内部原因包括：

（1）菌液和质粒

原因：测序模板与引物无法配对，或者配对能力较差，造成测序信号弱甚至无信号。

分析：菌液浓度太低甚至失活，或者载体为低拷贝，造成提取的质粒浓度低，测序无法产生足够信号；载体的信息错误，或者载体经过改造，测序引物与模板无法有效结合，造成测序无信号；客户提供的质粒浓度太低，质量太低造成测序无信号；引物发生降解导致测序无信号；引物定量不准造成测序无信号（引物与模板比例差异较大）；无插入片段。

（2）PCR切胶和已纯化

原因：测序模板与引物无法配对，或者配对能力较差，造成测序信号弱甚至无信号。

分析：测序引物与模板没有结合位点；测序引物或者模板，已经发生降解；样品浓度太低，造成纯化之后的模板浓度太低，测序无法产生足够信号;PCR产物送样量太少，造成DNA总量太少，纯化之后无法产生足够模板，测序信号弱，甚至无信号；PCR片段大于2000bp时，纯化效率显著降低，造成模板浓度不足，测序信号偏弱（作出这个判定时要根据已经回收后的产物电泳亮度才行）

（3）引物：

自备引物太长造成自连或walking引物有较重的引物二聚体、错配(错配会导致多个结合位点，出现双峰，不是无信号)、发卡结构等造成测序无信号；引物浓度太低或者太高都可能造成测序无信号；引物发生降解或者被污染造成测序无信号；简并引物、引物过长、引物不纯等导致测序无信号。

（4）其他

困难模板，样品在前端存在高级结构，引物结合上去之后无法继续测通；Buffer种类的不合适；PCR模板（PCR已纯化和质粒是客户自己提供的，如果模板溶于TE会导致信号衰竭，无信号，各种乱峰，是因为TE溶液里的EDTA导致，我们把模板重新洗脱即可重新测序）含有抑制物导致产量低导致无信号；PCR（引物退火，不是PCR）退火温度太高，延伸时间太短导致无扩增产物而导致测序无信号。