实验试剂 NaCl溶液(100mg/ml)。 实验设备 电导仪、天平、温箱、真空干燥器、抽气机、恒温水浴锅、注射器。 实验材料 小麦、韭菜叶片 实验步骤 1. 制作标准曲线：如需定量测定透性变化，可用纯NaCl配成0、10、20、40、60、80、100μg/ml的标准液，在20～25℃恒温下用电导仪测定，可读出电导度。 2. 选取小麦或其他植物在一定部位上生长叶龄相似的叶子若干，剪下后，先用纱布拭净，称取二份，各重2g。 3. 一份插入小杯中放在40℃恒温箱内萎蔫0.5～1h，另一份插入水杯中放在室温下做对照。处理后分别用蒸馏水冲洗二次，并用洁净滤纸吸干。然后剪成长约1cm小段放入小玻杯中（大小以够容电极为度），并用玻棒或干净尼龙网压住，在杯中准确加入蒸馏水20ml，浸没叶片。 4. 放入真空干燥器，用抽气机抽气7～8min以抽出细胞间隙中的空气；重新缓缓放入空气，水即被压入组织中而使叶下沉。 5. 将抽过气的小玻

实验原理 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。 DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过（牛小肠碱性磷酸酶）CIP处理克服。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中的温度，即12~16℃，连接12~16h （过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 pMD18-T Vector 是一种高效克隆PCR 产物（TA Cloning）的专用载体。该载体由pUC18 载体改建而成，在pUC18 载体的多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进

实验步骤 1. 交联和细胞收集 1) 取 2 个 150 cm2 培养皿的融合细胞（每皿细胞数约 1 X 107 - 5 X 107 个）。向培养基中滴加甲醛以使蛋白和 DNA 相交联，甲醛的终浓度为 0.75%（体积百分比），室温下轻轻摇动 10 分钟。 2) 加入甘氨酸至终浓度为 125 mM，轻轻振荡孵育 5 分钟。 3) 用 10 ml 冷 PBS 洗涤细胞 2 次。 4) 用 5 ml 冷 PBS 刮下细胞，转移至一个 50 ml 离心管中。 5) 用 3 ml PBS 洗涤培养皿，收集剩余细胞至 50 ml 离心管中。 6) 1000 g 离心 5 分钟。 7) 小心吸弃上清液，用 FA 裂解缓冲液重悬沉淀（每 1 X 107 个细胞加 750 μl）。 2. 超声 1) 将裂解液超声处理以使DNA断裂成约 500-1000 bp 的片段。不同的细胞系需要不同的超声时间，因此需分别进行优化。 2) 超声处理后，4

实验原理 Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V /核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V /核酸染料 )。 实验试剂 1. PBS缓冲液：含0.1%NaN3 ，过滤后2-8°C保存。 2. Annexin V Binding Buffer缓冲液(Cat. No. 66121E)：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。 3. Annexin V试剂与核酸

实验步骤 1. 抗Fab片段抗体亲和层析纯化法 1) 偶联抗人或抗鼠Fab片段抗体到Protein G Sepharose，将纯化的抗人或鼠Fab片段抗体以2mg/ml的比例与Protein G Sepharose凝胶珠溶液混合，室温旋转孵育1h。用10倍量的0.2mol/L硼酸钠(pH值9.0)洗两次，4 000r/min离心5min，用10倍量的0.2mol/L pH值9.0硼酸钠溶液，重悬凝胶珠子，加入足够量的DMP(dimethylpimelimide，Sigma公司)至终浓度为20mmol/L左右，室温旋转混合孵育30min后，离心去上清，加入0.2mol/L乙醇胺终止反应。继续在乙醇胺溶液中封闭2h，用PBS清洗数次，用PBS悬起来后制备2ml亲和凝胶柱。 2) 100ml IPTG诱导表达的Fab片段菌液，4℃ 4 000r/min离心15min。用pH值7.2的PBS 10ml悬起沉淀物，反复冻融三次，12 000r/min 4℃离心20min，取上清，过0.45μm滤膜，收集滤过溶液。 3

实验原理 LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(FolIn-酚)的结合与发展。其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe & PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。 LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3~15倍，约是双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。 1. 双缩脲法的原理双缩脲(NH2 -CO-NH-CO-NH2 )在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双

实验试剂 1. RIPA Buffer配制 基础成分： Tris-HCl(缓冲液成分，防止蛋白变性) NaCl(盐份，防止非特异蛋白聚集) NP-40(非离子去污剂，提取蛋白；用H2 O配制成10%储存液) 去氧胆酸钠(离子去污剂，提取蛋白；用H2 O配制成10%储存液；避光保存) 注意：准备激酶(致活酶)实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。 RIPA蛋白酶抑制剂 苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存) EDTA(钙螯合剂；用H2 O配制成100mM的储存液，PH7.4) 亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2 O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存) 抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2 O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存) 胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存) RIPA磷酸(酯)酶抑制剂 激活的Na3 VO4 (用H2 O配制成200mM的储

实验原理 混合的单核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T细胞则通过尼龙毛柱，这是获得富含T细胞群的有效方法。 实验设备 1. 尼龙毛(Femwall Laboratories,LP－1 Leukoqak leukocyte Filters)。 2. 烧杯、铝箔、漏斗、一次性手套等。 3. 装填尼龙毛柱，一次性注射器。 实验材料 取自然沉降的上层血浆，过聚蔗糖—泛影葡胺分层液后，获取的血浆和分层液之间的单个核细胞层。 实验步骤 1. 尼龙毛的清洗与干燥 1) 戴上已经洗去滑石粉的一次性手套，将尼龙毛(1包或2包，每包35g)放入烧杯中，加入蒸馏水或去离子水，用铝箔盖上烧杯并煮沸约10min。 2) 冷却至常温，倒入漏斗内，使水滴干。 3) 重复1)、2)步骤6次。 4) 将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内，37℃温箱干

实验原理 我们知道微生物都具有生长旺、繁殖快的特点，单细胞微生物如细菌、酵母菌的个体细胞的增大即细胞物质的增加是有限度的，细胞长大到 一定程度就开始分裂繁殖，菌体数量增多。细菌旺盛生长时几十分钟就可繁殖一代。 因此他们的生长往往是通过繁殖表现出来的，本质上是以群体细胞数目增加为生长标志。丝状微生物如放线菌、霉菌的生长主要表现为菌丝的伸长和分枝，他们相互缠绕，很难分清个体与个体之间的界限，所以通常以菌丝的重量增长(细胞质量的增加)或菌丝生长速度间接来衡量生长状况。目前测定微生物数量的方法有直接法和间接法。直接法包括血球计数板法、涂片染色法、比浊法等；间接法又包括平皿菌落计数法、液体稀释法、薄膜过滤计数法等。测定细胞物质量的方法有定氮法测、DNA法、测定细胞干重法、测定细胞湿重法、生理指标测定法等。 为了学习微生物的生长规律，增进了解微生物生长旺、繁殖快的特点，以酵母、放线菌和黄瓜枯萎病菌作为实验材料，本实验采用了干/湿重法、血球计数法直接计数、比浊法以及菌丝长度测量法,测定了放线菌及黄瓜枯萎病菌的生长量和黄瓜枯萎病菌的生长曲线，绘制了酵母生长

实验试剂 1. 大鼠弓形虫IgG抗体定量检测试剂盒(ELISA) 2. 蒸馏水 实验设备 1. 37℃恒温箱 2. 标准规格酶标仪 3. 精密移液器及一次性吸头 4. 一次性试管 5. 吸水纸 实验步骤 1. 准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。 2. 配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。 3. 加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍)；空白对照孔不加。 4. 温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。 5. 洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。 6. 加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对

实验原理 常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌W水性高，平均分子量为400，000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 实验试剂 1. 比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。 2. Hank's液(无Ca２＋ 、Mg２＋ ) 3. 10％小牛血清RPMI1640 4. 0.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。 5. 肝素用Hank's液或生理盐水稀释成500单位／ml，人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。 试剂配制： 1. Hank's液

实验试剂 1．类风湿免疫诊断试剂盒：人变性IgG致敏的胶乳颗粒，阳性血清，阴性血清。 2．标本：被检血清56℃30分种灭活，可阻止假阳性凝集。 3．生理盐水。 实验设备 毛细管、刻度吸管、试管、牙签、黑色方格反应板、微量震荡器等 实验步骤 【操作方法】 1．先用生理盐水将被检血清、阳性血清、阴性血清做1:20稀释。 2．于黑色反应板上取三个方格，用毛细管分别加1:20被检血清、阳性、阴性血清各1滴。 3．于各方格内分别加胶乳试剂各一滴（每滴约0.05ml）。 4．立即旋转摇动玻板或用微量震荡器震荡，使两者充分混匀，3分钟内观察结果。 【结果观察】 1. 阳 性： 3分钟内出现明显而均匀的凝集颗粒、液体澄清者； 2. 阴 性： 3分钟内不凝集、仍保持均匀乳胶状者。 3. 定量测定：可将血清作倍比稀释，重复上法测定，以出现凝集的血清最高稀释度为RF的滴度。 【结果评价】

实验原理 将加有抗凝剂的血液置于一特制的具有刻度的血沉管内，置于血沉架上，红细胞因重力作用而逐渐下沉，上层留下一层黄色透明的血浆。经一定时间，沉降的红细胞上面的血浆柱的高度，即表示红细胞的沉降率。家畜有的疾病可以引起红细胞沉降率的显著加速，故测定红细胞沉降率具有临床诊断价值。 实验试剂 109 mmol•L-1 柠檬酸钠（柠檬酸钠（Na3 C6 H5 O7 ?2H2 O）32 g，溶于1000 ml蒸馏水中），75%酒精。 实验设备 血沉管（根据动物可采取的血量选择不同长度的血沉管），血沉架，试管，1 ml移液管，刺血针，注射器及针头，带盖的小瓶，干棉球。 实验材料 兔或鸡 实验步骤 1．保定实验动物。如用牛、马、羊采血，则剪去颈静脉附近的毛，用碘酊消毒，然后用消毒的采血针刺破颈静脉。当血液循采血针流出时，于其下承接一有刻度的试管，试管中预先加有3.8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，抗凝剂和血液的容积比例为1：4，如用兔采血，直接采其心血

实验原理 大分子DNA(一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb)在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”)，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE)。通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE)设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。FIGE也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一

实验试剂 光敏素试剂盒 光敏素试剂醋酸盐 亲和素－碱性磷酸酶检测系统 亲和素－碱性磷酸酶 BCIP(实验时 10mg溶于200μlDMF中) NBT (实验时 15mg溶于200μl70%DMF中) 二甲基甲酰胺（DMF)，仲丁醇，3ＭNaAC无水乙醇 实验设备 光标记灯、离心机 实验步骤 1. 在一支灭菌的Eppendof离心管中加入20μl探针DNA(0.5-1μg/μl，溶解于水中 2. 避光条件下加等体积的光敏生物素醋酸盐并混匀。 3. 将装有反应液的离心管置于冰模中，暗室中在光标记灯下照射30分钟（灯距样品15cm）。 4. 加入无菌水至总体积为100μl 5. 加入100μl仲丁醇，混匀。10000rpm离心10min，去上层液，再加入仲丁醇，离心，使水相浓缩至30-40μl。 6. 加入4μl的3M NaAC，混匀，再加入２体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃过夜或-7

实验原理 团集素是牛血清中的一种蛋白质，它与结合在细胞表面和循环中的免疫复合物上的补体C3碎片有强烈的结合性。当把团集素包被在固相载体后，被检血清中结合有补体的免疫复合物就可与其结合，用同位素或酶标记的抗体即可检出。团集素无种属特异性，耐热，能长期保存，因此，用团集素检测循环免疫复合物更为方便。 实验试剂 1. VBS(含Ca2 、Mg2 ) 2. pH值7.2、0.15mol/L PBS(含0.02mol/L EDTA) 3. pH值5.4、0.01mol/L PBS 4. 牛血清 实验设备 1. Sepharose 4B 2. DEAE纤维素柱用pH值8.0、0.01mol/L EDTA、0.03mol/L PBS(含0.03mol/L NaCl)平衡 实验步骤 1. 提取方法 1) 取牛血清1600ml，56℃灭活30min。 2) 加等量VBS(含Ca2 、Mg2 )，混合后

实验原理 酶具有高度专一性，一种酶只能催化一种或一类底物发生反应，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时，能使班氏试剂的Cu2 还原成Cu1 ，生成砖红色Cu2 O沉淀。淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。通过上述特征性反应，并以蔗糖等作对照，便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。 实验试剂 1. 1％淀粉称取淀粉1g，加少量水调成糊状，加入煮沸的0.3％NaCl溶液至100ml。 2. 1％蔗糖溶液 3. 班氏试剂 A液：取柠檬酸钠173ｇ，无水碳酸钠100ｇ，加水600ml，加热溶解，冷却后稀释至850ml；B液：取结晶硫酸铜（CuSO4 ·5H2 O）17.3ｇ溶于100ml预热的蒸馏水中，冷却后加水至150ml。将A液缓慢倒入B液中混匀置试剂瓶备用。 4. 碘液：称取碘4g、

实验材料 1. 供试植物：番茄、黄瓜、甘蓝、烟草 2. 供试昆虫：丽蚜小蜂、烟粉虱 实验步骤 1. 昆虫培育 (1) 在室内用网罩培育寄主植物，当苗高达30 cm左右时，按每叶片上5 头的比例接入粉虱成虫； (2) 接种48～72 h 后轻轻摇动植株，以赶走大部分成虫； (3) 移入到塑料罩中，用吸有敌敌畏原液2～3 滴的滤纸熏蒸10～12 h； (4) 将带有粉虱卵的植株移入另一笼罩内培育； (5) 12 d 后，当粉虱若虫发育到2～3 龄时即接入丽蚜小蜂成蜂。 2. 丽蚜小蜂对番茄上烟粉虱和温室粉虱的控制作用，设3 个处理:两种粉虱若虫同时存在的选择性试验；烟粉虱和温室粉虱若虫分别单独存在的非选择性试验。每个处理10 个重复。 (1) 选择粉虱若虫较多且分布均匀的番茄叶片，计数若虫数后插入三角瓶中，用中空的玻璃罩罩上，并用细布封口； (2) 将24 h 内羽化的丽蚜小蜂雌蜂按益害比1∶

实验原理 SBP-box基因家族是植物特有的转录因子基因家族。这类基因编码的蛋白质序列中包含一个高度保守的SBP结构域，并能够特异结合在植物花分生组织识别基因SQUAMOSA及其同源基因的启动子区段，以调控其表达。 实验步骤 1. 拟南芥和水稻基因组中SBP-box基因的鉴定 在TAIR数据库(http://www.arabidopsis.org)中获得拟南芥中已知的SBP-box家族基因编码的蛋白质序列。利用Pfam软件预测这些蛋白质中包含的SBP结构域。再利用这些SBP结构域区段序列作为检索序列，使用Blastp搜索TIGR拟南芥注释数据库(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/athl/)和TIGR水稻基因组注释数据库(http://rice.tigr.org/tdb/e2k1/osal/index.shtml。如果检索到的蛋白质序列符合E ≤10-10 ，将被作为候选蛋白质序列。再利用Pfam工具鉴定这些候选蛋白序列中是否包含SBP结构域。若存在SBP结构域，则认为其属于SBP-

实验原理 血液的组成是： 　　　　　　血浆：优良溶剂，含蛋白质、葡萄糖、无机盐、代谢产物、O2、CO2 血液　　　　　　　 红细胞：含血红蛋白，容易和O2和CO2结合 　　　　　　血细胞　　白细胞：具免疫（淋巴细胞），吞噬机能 　　　　　　　　　　　血小板：止血，凝血 血型：指红细胞上所含抗原的不同，应用抗原与抗体的反应，产生凝集与否，对血型进行判断： A型：红细胞上具有A抗原，能与特异性抗体A发生凝集反应，而不与B抗体发生凝集反应。 B型：红细胞上具有B抗原，与特异性抗体B发生凝集反应，而不与A抗体发生凝集反应 AB型：红细胞上具有A抗原和B抗原，既与抗体A发生凝集反应，也与抗体B发生凝集反应 O型：红细胞上缺乏A抗原，也缺乏B抗原，均不与抗体A或抗体B发生凝集反应。 实验试剂 抗A血清、抗B血清、70％乙醇 实验设备 显微镜、载玻片、消毒药棉、一次性采血针 实验材料 参试