吸光和发光组织样品的常用测量参数 像素是显微图像分析系统的最小测量单位，通过它我们不仅能够得到待测范围内的几何形态信息，如面积、周长和直径等等，还可根据样品是否能够吸光或发光来测量其物质的总含量。在组织化学和免疫组织化学中常用荧光素来标记物质，使被测量物质产生有色荧光，从而进行分析。此外，在原位杂交技术中，采用放射自显影的标本也可以作为发光组织细胞样品使用显微图像分析系统进行分析。 （一）眼光组织细胞样品的测量 对于吸光组织细胞样品，图像分析系统至少能以下列三种参数来表述细胞待测物质的计量结果： 1．积分光密度(integrated optical density，IOD)，又称积分吸光度，是被测量范围内各像素吸光度的总和，表述测量范围内各像素吸光物质的总含量，测量范围可为面积或体积。 2．平均光密度(average optical density，AOD)，又称平均吸光度，是被测量范围内各像素吸光度的算术平均值，表述被测量范围内各像素吸光物质含量的平均水平，可反映此范围的染色深浅程度。 3．平均光密度方差 反映被测量范围内务像素染色深浅差异的指标，称为平均光密度方差(variance

显微图像分析处理程序 使用显微图像分析系统处理显微图像时，使用者实际操作很少，几乎完全是通过鼠标来操纵复杂的运行过程，计算机软件可按实际需要行使其功能。计算机屏幕上显示多项指令，由鼠标指明你所需要的程序即可。虽然不同品牌和不同型号的显微图像分析系统的具体性能参数不同，但在使用中基本处理过程相同．区别只在于对显微图像的不同采集参数和处理软件的设定和使用上。显微图像处理的基本过程包括制作切片样品、获取图像、图像分割、目标测量、统计分析和结果输出。 《一》制作切片样品 显微图像分析系统所用的切片与常规组织学切片的制作方法及要求基本相同，可根据研究者的目的选择适当类型切片。 《二》获取图像 通过显微镜将切片图像放大，成像在摄像机上，完成光／电转换，再经模／数转换为数字信号输入计算机。在计算机屏幕上显示的数字化显微图像由于各种原因(如：图像采集卡的性能、显微镜及光源等)都会对图像产生影响，难以获取真实的目标信息，所以要通过合理的软件处理使原始数字图像得到适当变化，以适应人的视觉信息和获取特性，更便于图像目标信息的提取。 《三》图像分割 图像分割是将图像中需要测量的目标从背景中分割出来，以便于计

随着生命科学 研究的突飞猛进和各门学科定量研究的快速发展，图像分析系统在医学研究中的应用越来越广泛．并逐渐成为组织化学和免疫组织化学定量分析的主要手段。为了得到比较客观的图像分析结果，应该充分考虑诸多因素对图像分析系统的影响，并尽可能使实验组与对照组的处理条件保持一致，应用注意事项如下： 1. 设计在先，测试在后 这是在进行图像分析时最容易忽视的问题。在实验之前的设计中，要满足有关测试所需的基本条件，如图像的来源是否带有偏差抽样，放大倍数是否相等。这些图像可能因为来源不符合图像分析系统的基本原理和应用条件而存在明显缺陷，勉强测试和分析很可能导致错误结果，得出错误结论。 2. 测试样本的代表性 应用随机抽样的方法来保证测试样本具有足够的代表性。使用足够的样本数量，一定要注意到照片数或视野数并不能代替实际研究对象的例数进行统计学分析。 3. 实验操作过程的一致性 用于定量分析的标本，从取材和固定开始的各项操作和每一步骤的处理应该相同。对照组与实验组的组织块大小与厚度应一致；切片厚度、固定方法也要一致；如用贴片法，实验组与对照组的切片最好裱在同一载玻片上，如用漂染

激光扫描共聚焦显微镜在组织化学和免疫组织化学中的应用 激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confcal microscope,LSCM)是激光、电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段相互渗透的产物。由于其高分辨率，高灵敏度及高放大率等特点，在细胞水平上能作多种功能测量和分析，如荧光定量测量、共聚焦图像分析、三维图像重建、活细胞动力学参数监测和细胞间通讯研究等，成为生物医学重要的研究工具。一台配置完备的激光扫描共聚焦显微镜已经在功能上完全取代了以往任何一种光学显微镜，它相当于几种制作精良的常用显微镜有机组合，如倒置显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜及相差显微镜等，可谓是普通光学显微镜质的飞跃。激光扫描共聚焦显微镜除能对组织细胞进行三维图像分析和各种荧光标记物的微量分析外，还能进行细胞内Ca2+和pH值等动态分析测量、细胞受体移动检测、膜电位变化检测、酶活性和物质转运测定等。因此，它可以对组织细胞的多种功能进行自动高效地微量定位和定量。 激光扫描共聚焦显微镜在组织化学和免疫组织化学中的主要应用是通过一种或多种荧光探针标记后，对固定或活体组织细胞标本进行观察研究，免疫荧光组

光学切片 激光共聚焦成像的特性使其不仅能获得胜过普通显微镜的分辨率，同时具有深度识别能力和纵向分辨率，从而可以清晰地观察较厚的标本，并可以掌握其细节。以一个最小步距0.1um的微动步进马达控制载物台升降，使聚焦平面依次位于组织标本的不同层面，可以逐层获得标本相应的光学横断面图像。这一过程称为“光学切片”，这种功能称为“显微CT”。如图所示，用激光扫描共聚焦显微镜对经过荧光染色的神经元从细胞顶部按照Z轴步距，逐层向细胞底部进行断层扫描，即可获得该神经元相应的光学横断面图像。图中可以清楚地发现，在细胞顶部，其胞体面积及突起数量很少，然后依次增加；在细胞中间部位胞体面积和突起数量最多，而后又依次减少；细胞底部胞体面积明显减少，突起已经基本消失。同时，激光扫描共聚焦显微镜还可以利用免疫荧光组织化学以及原位杂交方法的双重或多重标记同时显示被检细胞亚细胞结构和靶分子(蛋白或基因等)与细胞或所在组织的关系。神经元光学切片图使用激光扫描共聚焦显微镜对经过荧光染色的神经元从细胞的顶部按照Z轴步距，逐层向细胞底部进行断层扫描，获得该神经元相应的光学横断面图像

激光扫描共聚焦显维镜定量分析的注意事项《一》制备高特异性和高效价的荧光抗体 标本只有在用荧光探针标记的前提下才能进行共聚焦显微镜检测．制备高特异性和高效价的荧光抗体是检测的关键。这就要求选用高质量的荧光素和高特异性与高效价的免疫血清。同时还要对荧光抗体进行质量鉴定，主要是进行特异性和敏感性鉴定。《二》标本制作要求 1．标本厚度 组织切片或其他标本不能太厚，否则激发光多数消耗在标本下部，而物镜观察的上部不能被充分激发。 2．载玻片 载玻片要光洁，无自发荧光；载玻片厚度应在0．8～1．2mm之间，太厚会吸收较多的光，不能使激发光在标本上聚焦。 3．封固剂 甘油必须无色透明，无自发荧光。由于荧光在pH 8．5～9．5时较亮，不易很快退去，常用甘油加入0．5mol／lpH 9．0～9．5的碳酸盐缓冲液的等量混合液封片。《三》定量研究的要求 1．随机性 (1)在感兴趣区域内随机抽样，不能主观地选择一些便于定量的“理想切片”，这种“理想切片”不能代表所要研究的整体区域。 (2)在随机抽取的切片上，应随机抽取观察视野。 (3)在随机抽取的视野中，通过连续观察“光学切片”，得到感兴趣结构的三维定量信息

体视学的基本概念 对各种生物结构的形态学研究是医学各领域研究的重要方面，尤其是定量形态学研究。对器官的整体结构水平形态学研究相对比较容易，比如用排水法测量肝脏的体积则可以清楚地了解正常肝脏与患有肝硬化病人肝脏的体积差别。但是随着科学的发展，研究者越来越关心人体在微观结构上的形态特征。任何组织结构，如细胞、细胞间质、细胞器以及某种染色阳性结构等，均为具有一定形状和空间分布的几何物体。结构的形态学描述包括两个方面：一是该结构的定性描述，二是其定量描述。免疫组织化学技术对组织细胞结构的定性研究是本书的重点内容之一，而对于这些已定性的微观结构定量研究则成了难题，因为通常只能通过二维切片来观察这些微观结构。定量研究的内容包括体积、表面积、线性结构的长度、颗粒结构的数量等，这些内容应如何进行研究呢? 20世纪80年代以来，丹麦科学家Gundersen建立的现代无偏体视学方法为微观形态结构准确定量研究提供了可靠方法。当我们谈到现代体视学方法时，需感谢Gundersen教授对体视学的贡献。因为当今在国际上广泛应用的现代体视学方法绝大部分是由以Gundersen教授为代表的丹麦科学家发明。体视学方法是一

体视学几何探针 在明确二维参数与三维参数之间的关系之后，欲得到三维数据首先要准确有效地获取二维参数。在体视学中这些问题非常容易解决，只要利用适合的几何探针(geometric probes)和恰当的计数方法便可以得到。体视学的测试探针包括零维的测试点(test point)、一维的测试线(testline)、二维的测试框(testframe)、三维的体视框(disector)。几何探针a.为测试点；b.为测试线；c.为测试框 利用几何探针进行二维参数计数 1．测试点计数 计数位于所有特征结构断面内的测试点数。 2．交叉点计数 计数测试线与所测特征结构断面边界线之间形成的交叉点数。 3．轮廓计数 计数位于测试框“内”的所测特征结构断面的数量。基于这些二维参数的计数可以获得体积分数(或称体积密度)、表面积密度及长度密度的信息。下面将逐一介绍这些几何探针的使用、计数原则以及计算公式。参数、探针与维数之间的关系 不论在二维还是三维定量信息的计算中，人们一般认为只要定量，则需计数数以千计的点，但事实并非如此。为了估算的准确性，在体视学计算时，一个最重要的方面是抽取足够的观察视野，以减少由于视野之

大脑研究抽样过程 随机选择一侧大脑半球，将其包埋于6％琼脂中，切取等距离脑组织切片，切片厚度为7mm，共切取20张切片。我们确定从一侧大脑半球抽取5块大脑白质进行研究，首先，将从20张脑组织切片中抽取5片，即每4张等距切片中抽取一张(每隔3张抽取一张)。从前4个数字当中随机选择一个，这个数字则作为第一张脑片的抽取位置，假设选择3，则第3张脑片作为第一个脑组织块抽取的位置，然后每隔3张脑片抽取一片，即3，7，11，15，19号脑片。由于脑片较大，还需在所得脑片上再次抽取组织块。在所得脑片上随机叠放等距有孔测试点，这些测试点排列均匀，在测试点其中白质的部位取组织块。可使大脑白质每个部位有均等的机会被抽取。 大脑半球连续等距随机抽样示意图一侧大脑半球连续切片共20张。每片7mm。共抽取5张。则每4张抽取一张。第一张切片在1～4之间的随机数字中产生．如果为3，应抽取的组织切片为3，7，11，15，19 大脑白质随机抽样圈在随机抽取的脑组织块上随机叠放一张具有等距离孔的塑料胶片。因为塑料胶片上的孔击中大脑白质的概率是随机的。所以．当孔击中大脑自质．便在该处抽取一个组织块 实际应用中，可自己设计抽

三维空间内务向同性的概念及各向同性切片的制作 为正确地得到特征物在三维空间内长度和表面积等，必需对其做方向性随机抽样。如果特征物在三维空间内各个方向均匀分布，即具有各向同性，如肾小体的毛细血管球，可通过组织作任意方向切片，然后在切片上进行二维研究，通过所得二维数据推断特征物的三维结构信息。如果特征物在三维空间内呈各向不同性分布，则需通过组织制作各向同性切片，并在其中获取数据。制作各向同性切片的方法有定向法(orientator)和球切法(isector)。 球切法：采用有圆形小腔的塑料模具，将组织块放人小腔内包埋，使包埋介质(如树脂)充满小腔，包埋介质变硬后形成球形包埋块。把球形包埋块取出，在平面上任意滚动，然后对组织块按常规电镜包埋方法包埋。“球切法”原理颇为简单，利用球面的各向同性特征，在平面上任意滚动球形包埋块，相当于用“盲法”随机确定球面上一个均匀随机点，由此确定空间内一个均匀随机方向。但是，“球切法”需要专门包埋模具，而且仅适用于体积较小的组织块。球切法模具图图左侧显示一个特殊制作的模具，模具上的数字指示其深处有球形的腔。图中部显示一个弯曲的模具，可见球形腔的盖子已被切开，标

来自英国桑格研究所（Wellcome Trust Sanger Institute），西班牙IMOMA的研究人员开发出了一种可以用于发现癌基因的研究工具，利用这一工具，研究人员发现了与白血病相关的癌基因等。这一研究成果公布在Science杂志上。 领导这一研究的是英国皇家学院院士，英国桑格研究所所长Allan Bradley教授，这位著名的科学家在小鼠遗传学，以及功能基因组研究方面获得了杰出的成果。 癌症研究发展迅猛，但是依然需要更加先进，或者更加方便的研究工具，在这篇文章中，研究人员发现称为PiggyBac的转座子能帮助科学家们筛选新的致癌基因。 实际上PiggyBac（PB）早已久负盛名，PiggyBac转座子最初是在侵染昆虫细胞株的杆状病毒内首次分离得到的，转座子的遗传因子在DNA中从一处移动到另一处，并且允许插入外来基因或被置换。这种转座子能够在生物体染色体中准确地切出和转座，适用范围较广，因此早期在鳞翅目等昆虫中作为基因转移载体发挥作用。 研究人员利用基因工程PiggyBac嵌入小鼠基因组中，这些转座子能在染色体基因上跳跃，从而引起一些致癌基因被破坏，研究人员分析小鼠

PriCells: 动 脉平滑肌 细 胞 (Arterial smooth muscle cells) 平滑肌分类 尽管体内各器官所含平滑肌在功能特性上判别很大，但一般可分为两大类：一类称为多单位平滑肌，其中所含各平滑肌细胞在活动时各自独立，类似骨骼肌细胞，如竖毛肌、虹膜肌、瞬膜肌（猫）、以及大血管平滑肌等，它们各细胞的活动受外来神经支配或受扩散 到各细胞的激素的影响；另一类称为单位平滑肌，类似心肌组织，其中各细胞通过细胞间的电耦联而可以进行同步性活动，这类平滑肌大都具有自律性，在没有外来神经支配时也可进行近于正常的收缩活动（由于起搏细胞的自律性和内在神经丛的作用），以胃肠、子宫 、输尿管平滑肌为代表。还有一些平滑肌兼有两方面的特点，很难归入哪一类，如小动脉和小静脉平滑肌一般认为属于多单位平滑肌，但又有自律 性；膀胱平滑肌没有自律性，但在遇到牵拉时可作为一个整体 起反应，故也列入单位平滑肌。 平滑肌纤维的收缩原理 平滑肌纤维和横纹肌一样是以“肌丝滑动”原理进行收缩的。由于每个收缩单位是由粗肌丝（肌球蛋白）和细肌丝

实验材料： 1. 早产儿或死亡胎儿的皮肤，也可用手术取下的成体皮肤 2. 1000000U/L中性蛋白酶，0.25%胰蛋白酶 3. MEM和HBSS混合液，添加20mmol/L HEPES、200000IU/L青霉素和200mg/L链霉素和1.59g/L庆大霉素，HBSS 4. 手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊 5. 不锈钢网 6. 离心管（15ml、50ml） 实验方法： 1. 真皮的制备 （1） 取厚1.5mm的皮片，放入4℃用MEM和HBSS混合液浸洗，切成6cm×2cm的皮条。 （2） 在培养皿中加入HBSS，然后放皮条，使真皮面朝下，皮片漂浮其中。在37℃条件下，孵育8-10d，每3d换液1次。 （3） 用眼科镊将真皮与表皮分离，将真皮切成0.5cm2 小片。将真皮植块表皮面朝上放入培养皿中。 （4） 在-80℃和37℃下反复冻融植块10次，以去除存活的细胞成分，从而形成以胶原纤维网架为主的真皮组织，作

实验材料： 1. 婴儿脐带； 2. 不含Ca 2+ 和Mg 2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2； 3. 培养用液：M199培养液（含20%小牛血清）；0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA（1:1，V：V）混合消化液；D-Hanks液、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素； 4. 培养器具：玻璃插管与输液胶管，培养瓶或皿、白内障、眼科剪、镊子等； 培养方法： 1． 在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（长20cm以上，不宜超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分； 2． 在脐静脉两端开口处，分别用丝线扎紧并固定在50ml注射器和带输液胶管的玻璃插管上，注入D-Hanks液冲洗脐静脉，至无血迹； 3． 用止血钳夹住玻璃插管上的输液胶管，从另一端的注射器向脐静脉徐徐注入0.1%胶原酶溶液，至血管充盈。注意两端封闭，以防液体返流。立即放入37℃的无菌D-Hanks液内，15min后取出； 4． 通过注射器吸取收集酶液，同时注入含20%小牛血清的M199培养液冲

实验材料： 1. 2—3月龄的家兔胆囊； 2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2； 3. 培养用液：以DMEM/F12为基础培养基，添加10%的胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、2μg/ml胰岛素、10 ng/ml表皮生长因子以及100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素。酶消化液为0.125%Ⅳ型胶原酶溶液。组织清洗液为DMEM培养液，并添加200 IU/ml青霉素和200μg/ml链霉素；也可使用无Ca2+ 、Mg2+ 的D-Hanks液作为组织清洗液。 4. 培养器具：用鼠尾胶原或胶原蛋白包被的25ml培养瓶或24孔培养板、无菌普通培养皿若干。手术刀、眼科剪、镊等； 实验方法： 1. 选用2—3月龄的家兔，以戊巴比妥钠麻醉，开腹取出肝脏并从中分离胆囊； 2. 排净胆囊中的胆汁，将胆囊切开，用组织清洗液反复洗净胆囊粘膜表面的胆汁和粘液； 3. 在普通培养皿底面滴加1—2ml的酶消化液，胆囊粘膜面朝下，与酶消化液相贴。

实验材料： 1. 一般来自鼻咽癌活检组织或引产胚胎的鼻咽组织； 2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2； 3. 培养基：可使用ROMI1640培养液，添加20%胎牛血清、5μg/ml胰岛素、2.7×10-7 mol/L氢化可的松。也可用DMEM培养液； 4. 低血清培养液与无血清培养液：基础培养液均为DMEM/F12（1:1，V/V）混合液。配置时，添加1.2g/L NaHCO3 及15 mmol/L HEPES。低血清培养液是在基础培养液中再加入5μg/ml胰岛素、5ng/ml表皮生长因子、0.3mg/ml谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、5×10-7 mol/L氢化可的松以及1.25%胎牛血清。若去掉低血清培养液中的胎牛血清，再加1mg/ml牛血清白蛋白及10μg/ml转铁蛋白，即为无血清培养液； 5. 消化液：0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液，用D-Hanks液配制； 实验方法： 1. 取胚龄4—6个月水囊引产的胚胎，在无菌

实验材料： 1. 正常兔大脑皮质组织； 2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2； 3. M199培养液（含20%小牛血清、肝素25U/ml、HEPES 10mmol/L、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素）；D-Hanks液；0.05%胰蛋白酶溶液；0.05%胶原酶溶液；15%右旋糖苷（用Hanks配制，pH7.4）； 4. 匀浆器、手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊，止血钳，无菌消毒手术器械； 5. 离心管（15ml、50ml） 6. 网筛：110μm尼龙网筛 实验方法： 1. 通过颈动脉放血将兔处死，去头皮。将头颅取出并浸入75%的乙醇中，消毒约1min。在无菌状态下迅速取出兔大脑皮质。需小心剔除大血管和软脑膜； 2. 将脑皮质放入D-Hanks液中，漂洗数次后，将其剪碎。再移入含0.05%胰蛋白酶溶液的小瓶内，在37℃水浴中消化10—20min； 3. 用有血清培养液中止消化。置于玻璃研磨器内研磨，制成粗悬液。经孔径为110μm尼龙筛网过滤，将滤液以

实验材料： 1. 细胞来源：4周龄雄性Wistar或其它品系大鼠； 2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg2+ 的PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.4； 3. 消化液：2mg/ml胶原酶溶液。用DMEM培养液配制，并加入牛血清白蛋白20mg/ml； 4. 培养液a：DMEM培养液，10%胎牛血清、100IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素； 5. 培养液b：在培养液a中补充生物素33μmol/L与泛酸盐（pantothenate）17μmol/L； 6. 培养液c：基础培养液为DMEM/Ham F12（1：1，V/V）混合培养液，加入NaHCO3 15mmol/L、HEPES 15mmol/L，pH7.4。再加入生物素33μmol/L与泛酸盐17μmol/L及100IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素； 7. ITT培养液：在培养液c的基础上添加胰岛素5μ g/ml、转铁蛋白10μg/ml和三碘甲腺原氨酸（T3 ）200pm

实验材料： 1. 实验动物：5月龄兔； 2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg2+ 的PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.2； 3. 完全培养基：DMEM培养液，补充10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml 4. 化学限定性培养液：基础培养基为DMEM培养基，添加胰岛素6.25μg/ml、转铁蛋白6.25μg/ml、亚硒酸6.25μg/ml、亚油酸5.35μg/ml、牛血清白蛋白1.25μg/ml、丙酮酸盐1mmol/L、抗坏血酸-2-磷酸盐37.5μg/ml、地塞米松10-7 mol/L、TGF-beta;1 10ng/ml。另加青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml； 5. 离心管：15ml聚丙烯圆锥形离心管。 实验方法： 1. 在注射器中预先吸入3000U肝素，然后从兔髂骨嵴或胫骨抽吸7—8ml骨髓； 2. 将完全培养液加入取得的骨髓中，吹打分散细胞。计数有核细胞；

实验材料： 1. 材料来源：人眼、兔眼或者猪眼等； 2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH7.2； 3. 器械：小梁剪与无齿镊等； 4. 消毒液：200IU/ml的庆大霉素生理盐水； 5. 培养液：基础液由DMEM培养基加入HEPES 6.0g/L、NaHCO3 2.2 g/L以及L-谷氨酰胺0.06 g/L配制而成。应用液是在基础液内补加15%的胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml，并用5% NaHCO3 调节pH至7.0—7.2； 6. 培养器皿：培养瓶、24孔培养板或培养皿若干； 实验方法： 1. 将离体的供体眼球用200IU/ml的庆大霉素溶液浸泡消毒5min； 2. 无菌条件下，沿角膜缘后5mm处环形剪开眼球，剪断晶状体悬韧带，去除晶状体和玻璃体； 3. 将眼前段倒放在培养皿中，在显微镜下用无齿镊把虹膜抹离角膜