梯度凝胶电泳也通常采用聚丙烯酰胺凝胶，但不是在单一浓度（孔径）的凝胶上进行，而是形成梯度凝胶。从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化，如通常顶部凝胶浓度为5%，底部凝胶浓度为25%。凝胶梯度是通过梯度混合器形成的，高浓度的丙烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中，而后溶液浓度呈梯度下降，因此在凝胶的顶部孔径较大，而在凝胶的底部孔径较小。梯度凝胶电泳也通常加入SDS，并有浓缩胶。电泳过程与SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳基本类似。与单一浓度的凝胶相比，梯度凝胶有几个优点：①首先，梯度凝胶比单一浓度凝胶的分离范围更宽，可以同时分离较大范围分子量的蛋白质。单一凝胶电泳对于分子量超过其分离范围的蛋白质，过大或过小，都不能分离。而梯度凝胶孔径范围比单一凝胶大，分子量较大的蛋白质可以在凝胶顶部大孔径部分得到分离，而分子量较小的蛋白质可以在凝胶底部小孔径部分得到分离，所以分子量较大和较小的蛋白质可以同时得到分离。例如用4%～30%的梯度胶可以分离分子量5万～200万的蛋白质。② 另一个优点是梯度凝胶可以分辨分子量相差较小，在单一浓度凝胶中不能分辨的蛋白质。电泳过程中，蛋白质在梯度凝胶中迁移，经过的孔径越来越小，

质粒除有抗性基因外，往往还带有其他明显的筛选标记，最常用的是蓝白斑筛选（ -半乳糖苷酶系统）。此类载体携带lacZ’基因，它编码β-半乳糖苷酶的N-末端（α-肽），并且处于可被安慰诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解）诱导的启动子调控之下。质粒转化的宿主菌为LacZ△M15 基因型（含有编码N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因）。未重组的质粒转化宿主菌后，在IPTG 的诱导下，质粒与基因组分别表达缺陷但可以相互补偿的两个肽（即α-互补），形成了有功能的β-半乳糖苷酶，该酶能把培养基中无色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝。然而当外源DNA 插入质粒位于α-肽编码序列中的多克隆位点时，由于破坏了α-肽的阅读框架，因而不能表达出与宿主菌基因组表达的缺陷型β-半乳糖苷酶多肽发生α-互补。由于没有β-半乳糖苷酶的酶解作用，致使重组菌形成白色菌落。由此，可以借助蓝白斑很容易筛选出重组子.不过实际操作中发现当插入小片段时，重组子也有形成浅蓝斑的情况.即蓝色菌斑也有可能含外源基因。据最新

电泳是指带粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。例如蛋白质具有两性电离性质。当蛋白质溶液的pH在蛋白质等电点的碱侧时，该蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，相反则带正电荷，在电场中向负极移动，只有蛋白质溶液pH在蛋白质的等电点时静电荷是零，在电场中不向任何一极移动。 电泳现象早在1890年就被发现，1907年有人曾在琼脂中电泳，研究白喉毒素。1937年由Tiselius制成界面电泳仪，并开始用于蛋白质的研究。从此，人们才逐渐认识到电泳技术对于生物科学研究是一种重要工具。然而，界面电泳结构复杂，价格昂贵难于普及。1940年左右，以纸为支持物的电泳问世后，电泳技术得到迅速发展。 电泳技术以支持物分，可分为：纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，淀粉凝胶电泳，琼脂（糖）凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。经凝胶形状分有水平平板电泳，园盘柱状电泳及垂直平板电泳。各种类型的电泳技术概括如表。 各类电泳技术已经广泛地用于基础理论研究，临床诊断及工业制造等方面。例如用醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白；用琼脂对流免疫电泳分析病人血清，为早期诊断原发性肝癌提供资料；用高压电泳分离

1. 一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。 2. 加一抗后最好4℃过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。4℃也可使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温1小时即可。3. 磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。4. 最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。5. 抗体的稀释倍数也要适当，不同厂商也会有不同要求。6. 研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完phospho-p38抗体后，把相同的membrane做strip后再压p38，然后再strip一次，再压内标actin。7. 做磷酸化蛋白WB时，除了目标蛋白的band以外，往往会出现非特异性的band。磷酸化抗体不好的话，甚至会压出非特异性的band，而没有你想要的band，所以压片以后，你一定要根据markers比对一下，你压出的band分子量是否正确。8. 磷酸化蛋白WB时backgroud也往往较深，所

稀释计数法 滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。 第一天 细胞准备 将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100µl/孔，为每个病毒准备10个孔。放入37℃，5%CO2培养箱中培养。 第二天 加病毒 在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90µl培养液，往第一个管中加入10µl病毒原液，混匀后，吸取10µl加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。 吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。 第三天 追加培养液 在每个孔再加入100µl完全培养液，利于细胞的生长。 第五天 观察结果并计算滴度 在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒液的含量（µl ）。 定量PCR法

文转载于丁香园站友dlzhangyu的论坛大作，点此查看详情，感谢dlzhangyu站友的分享。 2011年鄙人做western的时候，发现目前的资料都很老，网上的资料也大多互相传抄，说法各异，于是综合了目前网上所能找到的资料和个人实际经验，编辑了这份western blot操作步骤2012版，内容包括主要操作步骤和所需要注意的有用的细节，并附上参考文献（原谅我无法像Endnote那样一一注明文献出处，只能大概标注出引用的参考资料），希望对大家有帮助。鄙人按下文的步骤操作已经做出来了稳定可重复的、背景干净的western条带了，所以相信你也行。为了节省时间，鄙人总结了一下western blot Quick Guide和一天做出western的具体时间规划，附在文末。初次发这么长的帖子，难免有错，欢迎批判指正。 背景： 蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被称为Western Blot。最开始做印迹的是一个叫Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这

一）、细菌性疾病主要细菌性疾病概述 由于鸭子的生理特性和鸡不同因此鸭子对一些常见疾病有抵抗力，对于一些细菌性疾病处理原则基本和鸡的相同。因此可以参考禽病的有关原则进行，限于篇幅在此不做过多叙述，仅将常见的一些疾病做一综述。1、传染性浆膜炎又称鸭疫里氏杆菌或里默氏杆菌病。主要危害八周龄以下的小鸭，其主要特征是引起鸭的心包炎、肝周炎、以及纤维素性腹膜炎。发病和死亡率均很高，为危害养鸭业主要的传染病之一。 发病特点：一般一周龄以内很少发病，但近年来发病有所增高。2-3周龄最易感。以皮肤损伤为重要的感染途径，因此饲养环境的管理非常重要，以防止地面等对鸭掌损伤。 发病鸭表现为嗜睡、缩颈，嘴拱地，脚软不愿意走动，行走摇晃，粪便稀薄呈绿色或黄绿色。部分出现腹部涨满现象。痉挛性点头，摆头。前仰后翻，有的出现角弓反张现象。 剖检主要表现为心包炎、肝周炎、以及纤维素性腹膜炎。心包粘连填充黄色纤维素性分泌物，肝脏多肿大，呈橙红色，质脆，胆囊多充盈。 本病多于大肠杆菌，沙门氏菌以及巴氏杆菌相识，应注意鉴别诊断。2、鸭大肠杆菌败血症所有年龄均易发，主要表现为下痢、粪便稀薄、恶臭，并带有白色黏液以及血丝样气泡，一

ELISA即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。Engvall 和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定，并命名为"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"。ELISA的基本原理是：①使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原（或抗体）与某种酶联结成酶标 抗原（或抗体），而且此酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；③测定时将受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原（或 抗体）按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体进行反应，再用洗涤方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合 在固相载体上的酶量与标本中受检的抗体或抗原量成一定比例；④再加入酶反应底物后，底物被酶催化后变为有色产物，根据其颜色反应的 深浅进行定性或定量分析，以了解被测标本中抗体或抗原含量。ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中 除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。引起ELISA测定错误结果的原

【求助】关于ROS的检测方法，谢谢参与者：llemontreeROS的检测方法都有哪些呢？比如HVA assay，luminol-enhanced chemiluminescence 方法等等，都有什么区别呢？谢谢参与者：lwjssryROS的测定方法细胞内ROS的检测可用DCF法[1，3，6][步骤参考6]细胞外可用ROS试剂盒[4，5]，步骤按说明书进行。以下是其他信息和文献：key words：关键词：二氯荧光素/（1） ； ；EPR法：election paramagnetic resonance（EPR，电子顺磁共振谱）Detection of ROS（活性氧类物质/活性氧）by election paramagnetic resonance（EPR，电子顺磁共振谱）（胰腺组织的ROS生成）。（2） ； ；DCF法： dichlorofluorescein （DCF）二氯荧光黄[1，8，13]活性氧检测试剂盒是利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，

自噬是近年来很热门的领域，搜了一下园子，发现没有这方面系统的介绍或讨论，但很多战友有这方面的疑问，加上本人最近对此也非常感兴趣，因此，借本版来专门讨论一下自噬（说实在的，自噬属于丁香园哪一个版块的范围我也选不好），与各位同行或有志于研究自噬的战友共同学习，也欢迎大家提出自己的看法，本人的目的就是交流。自噬的过程：步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，我把它翻译为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（加了个“可”字，意思是这种情况不是必然要发生的）。步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶

蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。 实验原理 考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。 考马斯亮蓝染色法的突出优点是： (1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋

Endnote版本：Endnote X4 各数据库入口：上海交大医学院图书馆 操作系统：Windows 8 一、中文全文数据库 主要是万方（Wanfang）、中国知网（CNKI）、维普（VIP）数据库。 经过更新，这三大数据库都已经能够直接导出Endnote格式的参考文献，所以不再需要对应的过滤器（Filter）来导入文献。 从这三个数据库向Endnote导入中文参考文献的流程如下： 1，选中相应文献 2，点击与“导出参考文献”意思类似的按钮 3，导出的参考文献格式选择“Endnote” 4，点击“导出”，将相应TXT格式文件保存至电脑 5，点击Endnote Import按钮，按下图对相应选项进行设置 6，点击“Import”按钮，成功二、中文文摘数据库 主要是Sinomed（原CBM）。Sinomed数据库还未能导出Endnote格式的参考文献，需要特定的filter。楼主制作了一个，放在附件里，下载后解压，将CBM.enf放在安装路径\Endnote\Filters文件夹里，例如Endnote安装在C盘Program Files里的，具体路径就是

一、Transwell小室制备1. 无基质胶Transwell小室制备① 包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。② 水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃ 30 min使Matrigel聚合成凝胶。2. 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 µl预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。二、制备细胞悬液① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，

P38MAPK 信号转导通路 分裂原激活的蛋白 激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)家族是非常保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是信号转导过程中一组主要的信号分子，在发育和疾病发生过程中起重要作用。该家族有4个成员，即细胞外信号调节激酶(extracellular regulated proteinhnase l／2，ERK 1／2)，c―jun N端激酶(c―jun N―terminal kinase，JNK)／应急激活的蛋白激酶(stress activated protein kinase，SAPK)，P38MAPK，ERK5／BMK1(big mitogen―activated protein kinase，BMKl)。 MAPK的激活是细胞内磷酸化级联反应的最终步骤。MAPK在MAPK／ERK激酶(MEK或者MKK)的作用下于酪氨酸和苏氨酸残基处发生磷酸化而被激活。MEKl和MEK2是ERKl／2的激活剂，MEK5是ERK5的激活剂，MKK4和MKK7是JNK的激活剂，MKK3和MKK6是P38MAPKs的激活剂。经典的MA

ELISA 的技术要点包括三个方面：试剂的制备、反应条件的选择和操作的标准化。一、试剂的制备 ELISA 的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。以下叙述这些试剂的原料和制备方法。 （一）固相载体 可作 ELISA 中载体的物质很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。在 ELISA 测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。加之它的价格低廉，所以被普遍采用。 ELISA 载体的形状主要有三种：小试管、小珠和微量反应板。小试管的特点是还能兼作反应的容器，最后放入分光光度计中比色。小珠一般为直径 0.6 cm 的圆球，表面经磨砂处理后吸附面积大增加。如用特殊的洗涤器，在洗涤过程中使圆珠滚动淋洗，效果更好。最常用的载体为微量反应板，专用于 ELISA 测定的产品也称为 ELISA 板，国际通用的标准板形是 8×12 的 96 孔式。为便于作少量标本的检测，有制成 8 联或 12 联孔条的，放入座架后，大小与标准 ELISA 板相同。E

细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，其连有的炔烃基团在天然化合物中很少见，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中，基于Apollo®荧光染料与EdU的特异性反应即可直接并准确地检测出DNA复制活性。广泛应用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA损伤修复、病毒繁殖等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及各种药物的细胞增殖及活力筛选实验。 超越 BrdU？传统的免疫荧光染色（BrdU）检测方法需要 DNA 变性，抗原修复，抗原抗体过夜孵育，操作步骤复杂繁琐。并且由于 BrdU 抗体分子较大，嵌入 DNA 分子中的 BrdU 无法直接与 BrdU 抗体结合，必须先进行 DNA 变性操作才能使 BrdU 抗原表位暴露，但变性的程度可能导致错误结果。如果变性不充分，会导致 BrdU 难以暴露，无法检测，而且变性过程从边缘向中间渗透，会导致细胞核 DNA 的变性不均匀，边缘模糊不清。如果变性过分，则会导致 DNA 断裂，甚至降解，导致核染不均

MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。MTT的原理：活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀。由于一般介绍园子里已经很多，笔者将自己的心得按照实验流程与大家交流交流。1、培养好细胞点板。养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法。如果知道了细胞的名字，就可以上www.atcc.org检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是标准培养方法。当然可以根据自己实验要求进行修改。由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下：自己先将细胞养一段时间，大概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况。这时可以将细胞不进行计数，将消化好的细胞混匀后（可能是10 ml）直接在一个废弃（最好进行过无菌处理）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48 h能基本长满板底，假设50 微升的孔比较合适，而点板时没孔

酶联免疫吸附实验材料，试剂，溶液 1．酶标板，100μltip头，1ml Ep管，湿盒 2．包被稀释液（0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠buffer,pH 9.6）碳酸钠0.15g,碳酸氢钠0.29g,叠氮钠0.02g,加双蒸水至100ml,调至pH 9.6 3. 封闭液(5%小牛血清/PBS溶液)小牛血清5ml, undefinedPBS(pH 7.4)95ml 4. 洗涤液(PBST, pH 7.4)NaCl 0.8g, KH2PO40.02g,Na2HPO4.12H2O 0.29g, KCl 0.02g,Tween20 0.05ml,叠氮钠0.01g,加双蒸水至100ml,调至pH 7.4 5. 样本稀释液(PBS, pH 7.4) NaCl 0.8g, KH2PO40.02g,Na2HPO4.12H2O 0.29g, KCl 0.02g,叠氮钠0.01g,加双蒸水至100ml,调至pH 7.4 6. 酶标第2抗体(羊抗兔)稀释

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。1、Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase,PARP]等的裂解。方法：收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次， 5~

一、巢式 PCR 的定义巢式 PCR 是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR 引物扩增完整的片段。第一对 PCR 引物扩增片段和普通 PCR 相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次 PCR 扩增片段的内部）结合在第一次 PCR 产物内部，使得第二次 PCR 扩增片断短于第一次扩增。巢式 PCR 的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式 PCR 的扩增非常特异。 二、巢式 PCR 反应巢式 PCR 通过两轮 PCR 反应，使用两套引物扩增特异性的 DNA 片断。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮 PCR 产物内的一段 DNA 片断。 三、巢式 PCR 的实验步骤第一步：目标的 DNA 模板蓝色的第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片断（图中未显示可能的多种产物）。 第二步：使用红色标记的第二套引物对第一轮 PCR 扩增的产物进行第二轮 PCR 扩增。 由于第二套引物位于第一轮 PCR 产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位