相关专题 一、原理有机含氮化合物与浓硫酸共热消化，氮转化为氨，再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应，放出氨。将氨蒸馏到过量的标准无机溶液中，再用标准碱溶液进行滴定。根据测得的氨量，计算样品的总氮量。 二、试剂与材料 浓硫酸、硫酸钾-硫酸铜粉末(称取80g硫酸钾和20g硫酸铜(五水)，0.3g二氧化硒研细混合)、30%氢氧化钠溶液、2%硼酸溶液、0.01M标准盐酸、混合指示剂(田氏指示剂)储存液(取50ml0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200ml0.1%甲基红溶液混合，储存于棕色瓶中备用。此指示剂在PH5.2为紫色;PH为5.4为暗灰色或灰色;PH5.6为绿色;变色点为PH5.4)、硼酸-田氏指示剂混合液(100ml2%硼酸溶液，滴加约1ml田氏指示剂，摇匀后，溶液呈紫红色)、蛋白质样品、容量瓶、吸管、凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、微量滴定管、电炉 三、操作方法 1、样品处理：固体样品，应在105℃干燥至恒重。液体样品可直接吸取一定量，也可经适当稀释后，吸取一定量进行测定，使每一样品的含氮量在0.2-1.0mg范围内。 2

一、原理AFLP也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。但AFLP是通过PCR反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物，可以达到选择性扩增的目的。这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增。二、实验试剂Taq酶、EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI接头、E+A引物M+C引物、T4DNALigaseE和M引物、琼脂、过硫酸胺、丙烯酰胺、尿素、硝酸银、甲酰胺、 dNTPs、 二甲苯青、冰醋酸、玻璃硅烷、50bpMark三、操作步骤（一） 基因组DNA提取和纯化A 、参考实验一的大量提取DNA实验方法，B、DNA的纯化：用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的1/3已提取的基因组DNA进行纯化，首先用TE缓

细菌工程菌胞内表达主要分为两种形式，一种是在强启动子条件下的高效表达，由于蛋白的过度表达，使蛋白不能及时有效折叠而发生无规则卷曲，以固体颗粒的形式堆积于胞间质中，这就是所说的包涵体，另外一种是间质内的可溶性表达，即可以发生正常折叠，具有生物活性。一般情况下，细菌只要被正常破壁就可以通过离心的形式将包涵体和可溶性表达的蛋白分离开。超声破碎的条件一般是300 w，10 s/10 s，20分钟，具体条件可根据自身情况而定。 超声前菌体的准备：菌液离心后，先用PBS将菌沉淀洗2-3遍，然后按原菌液体积的1/5-1/10加入裂解液重悬菌体，裂解液的成分：50 mMTris-HCl, pH8.0, 2 mM EDTA，100 mM NaCl，加溶菌酶至100 ug/ml，0.1%Triton X-100。切记冰浴超声！ 如何判断是否超声完全：根据网友的经验，一般有以下几个方面：1. 外观判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。2. 液体的粘滞性：超声后菌液从枪头滴下不粘连。3. 高速离心：有用高速离心检测超声破碎程度的（一般用6,000 g 10 min, 比一般离心收集菌体的转速

细胞介导的免疫反应（cell mediated immune， CMI）在机体抗感染及抗肿瘤免疫、移植排斥反应和自身免疫病中发挥重要的作用。CMI的主要效应细胞之一为细胞毒T淋细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）。目前在医学基础与临床研究中重视CTL活性测定，将其作为了解机体细胞免疫功能和探索疾病机理的重要方法之一。经文学事业上的资助者的CTL活性测定方法为51铬（Cr）释放法，本法结果准确、重复性好，但也存在以下不足：1、使用放射性的51Cr不利于安全操作及废物处置，且需特殊测定仪器；2、51Cr自发释放率高，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而影响结果判定；3、51Cr半衰期（27.8天），无法用于需多次测定的动物试验；4、细胞共育时间短而试验操作步骤多，不能在单个细胞水平进行测定。因此多年来人们一直试图寻找可以替代51Cr释放法的CTL活性测定方法，如采用荧光标记、流式细胞分析和报告基因等技术的灵敏可靠、简单易行的非同位素测定法。一、荧光测定法1、定法（1）alamarBlue一步荧光测定法alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体

相关专题细菌 是一种形态小、数量多的生物。在微生物实验中，我们经常需要对细菌进行计数，想必大家都数得很不耐烦吧。今天小编将为大家介绍几种细菌计数的实验方法。细菌计数 1、计数器测定法 即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。 本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌 及霉菌孢子计数。 2、电子计数器计数法 电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。 该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。 3、活细胞计数法 常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的

iPS细胞在治疗血液疾病的应用Xu等将iPS细胞诱导分化为内皮前体细胞，然后移植到患有血友病小鼠的肝脏中，使病鼠出血不止的症状得到了有效地改善。Hanna等人将患病小鼠尾尖成纤维细胞重编程为 iPS细胞，然后通过同源重组的方法用人野生型 p A.珠蛋白基因替代了 pass珠蛋白基因,接着把遗传修饰后的 iPS细胞定向分化为造血祖细胞 (HPs),并将纯化后的 HPs移植入 hps /llps雄性小鼠中，Has有效地抑制了镰刀形红细胞贫血症症状。日本用人类iPS细胞制成血小板，日本东京大学干细胞生物学教授中内启光最近成功地用人类诱导多功能干细胞(iPS细胞)培养出血小板，这在世界尚属首次。中内启光等研究人员采用与日本京都大学教授山中伸弥同样的方法．向人类皮肤细胞植入基因，制成iPS细胞。在培养iPS细胞时，研究人员添加了人类骨髓细胞以及促进细胞增殖的蛋白质等物质结果iPS细胞分化成了血小板的前身巨核细胞；之后，巨核细胞进一步分化成血小板。血小板是哺乳动物血液的重要成分之一，具备收缩血管，形成止血栓，帮助止血等功能。手术中使用的血小板现在主要通过献血采集，在这种情况下血小板只能保存几天，十

Mycoplasma国内主要有三种译名，医学文献译为“支原体”（分枝原体，枝原体，类菌质体），动物医学文献译为“霉形体”或“支原体”，台湾、香港则译为微浆菌。 支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物。自然界分布广泛，种类多，有80余种，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解脲脲原体。 支原体无细胞壁，多呈不规则球状、长丝状，可分枝，营寄生共生或腐生。一般侵害对象为动植物，可造成多种疾病。 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95%以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（A.laidlawii），为牛源性。国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。 支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（某些支原体在人体是正常菌群）、培

淀粉酶属于水解酶的一种，是淀粉水解的生物催化剂。按降解方式分为α—淀粉酶、β—淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶和环糊精生成酶。α—淀粉酶将淀粉长链分子水解成短链分子时，以无规则的方式切断淀粉大分子内部的α—1，4甙键而使淀粉生成糊精、低聚糖等，因产物的末端葡萄糖残基中C，碳原子为α—构形，故称为α—淀粉酶．大多α—淀粉酶(个别品种除外)不能切断α—1，6甙键，也不能切断分支点附近的α—1，4甙键．目前，α—淀粉酶在我国产量较大，广泛应用于食品、酿造、制药和纺织等领域．用α—淀粉酶水解淀粉时，要注意水解条件．影响α—淀粉酶活性的主要因素：pH值、温度和金属离子。一般α—淀粉酶在pH值为5.5—8.0时活性较稳定，pH值小于4时，酶易失去活性．但有些α—淀粉酶是偏酸性或偏碱性的，如黑曲酶生产的α—淀粉酶最适合的pH值为4，在pH值为2.5、温度为40℃时，处理30min后仍有一定的活性，但在pH值为7、温度为55℃，处理15min，α—淀粉酶几乎失活。而用米曲酶生产的α—淀粉酶则相反，在pH值为7、温度为55℃时，处理15min，酶活性无损失，但在pH值为2.5时，酶的活性完全消失。目前所用的α—

不管是制备单抗还是多抗，抗原的设计与制备都是一个非常重要的问题，设计或者制备得不好的抗原有可能完全不能免疫出抗体来。 一个良好的抗原必须具体的条件： （1）分子足够大。对于多肽或蛋白质类的抗原来说，一个抗原决定簇（又叫表位，epitope），通常由6-8个氨基酸残基组成。而平均每5-10 kD才有一个表位，因此分子太小的多肽或蛋白是很难有一个表位的。 （2）外源性强。在个体形成的早期就对自身物质形成了免疫耐受，因此如果和机体内的物质完全一样或者是相似就很难引起机体的免疫应答。如果是利用免疫赦免区的成份（如大脑、眼球、睾丸内部成份）则不必考虑外源性。 （3）结构尽量复杂。简单重复的物质是不具有免疫原性的，拿明胶来说，它的分子量非常大，而且外源性也很强，但是组成明胶的氨基酸多为直链氨基酸，在体内容易被降解，因此它的免疫原性很弱。类似地，淀粉、核酸、多聚Lys的免疫原性也很弱。 （4）可降解性好。作为抗原，必须是可以降解的，塑料、不锈钢等难降解的物质免疫原也很弱。由D-型氨基酸组成的物质免疫原性也很弱，同样是因为机体不能降解D-氨基酸组成的蛋白或多肽。

经过了近5年既漫长又短暂的发展，iPS细胞技术已经取得了举世瞩目的进展。一个个突破性的成果既给我们带来了喜悦，也带来了新的挑战，细胞重编程有望迎来一个新的研究浪潮。尽管iPS细胞有着诱人的应用前景，然而，未来iPS细胞的研究也面临着许多亟需解决的问题：第一，效率问题。目前，诱导产生iPS细胞的率仍然很低，这与基因导人的方式整合位点、表观遗传学等多种因素有关。这已成为制约iPS从实验室走向临床的最大瓶颈。因此，如何提高iPS细胞的制备效率仍是人们普遍关注的问题。第二，安全性问题。现在诱导iPS细胞通常借助逆转录病毒为载体，将几种癌基因转入分化细胞诱导其成为iPS细胞，而这种方法就有可能会因为外源基因插入细胞基因组，干扰了内源基因的表达，从而诱发癌症。第三，机制问题。细胞的多能性受到转录因子网络和表观遗传学的复杂调控，那么，仅仅依靠导人的几个转录因子是如何完成这一复杂的任务，从而诱导出具有多能性的细胞呢?深入研究体细胞重编程的分子机制，调控机制以及体外定向诱导分化机制也是未来研究的重要任务之一。1，逆转录病毒和慢病毒载体导致肿瘤发生的潜在风险需要加以有效防范。2，需要深入研究比较iPS细胞

一、概述：ACCESS全自动化学发光免疫分析系统是由美国贝克曼公司制造与经销的，它采用微粒子化学发光技术对人体内的微量成份以及药物浓度进行定量测定。该系统具有高度的特异性．高度的敏感性．高度的稳定性等 特点；全自动操作，一次可以对60份标本进行24种项目的测定，只需10～30分钟就可完成第一个测定并打结果。二、分析方法及原理：ACCESS系统采用磁性微粒作为固相载体，以碱性磷酸酶作为发光剂，固相载体的应用扩大了测定的范围。以竞争法、夹心法和抗体检测等免疫测定方法为基础。试剂包装采用特殊的设计，每个试剂包有五个小室分别把不同的试剂分开，减少了交叉污染，保证了检测质量。三、分析范围：1、甲状腺功能：游离T3（FT3）、游离T4（FT4）、促甲状腺激素（TSH）、甲状腺素摄取率、总T3、总T4。2、贫血检查：铁蛋白（Ferritin）、叶酸盐（Folate）、维生素B12。3、变态反应：总IgE4、内分泌激素测定：β人绒毛膜促性腺激素（βHCG）、促黄体生成素（LH）、促卵泡成熟激素（FSH）、雌二醇（E2）、黄体酮（T）、垂体泌乳素（PRL）、皮质醇（Cortisol）。5、治疗药物检测：

PCR-引物设计原则 1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2. 引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 3. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4. 引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域

【实验原理】 神经的动作电位是神经兴奋的客观标志。当受刺激细胞（或神经纤维）而兴奋时，细胞膜外电位会因动作电位的产生和传导而出现一系列变化。发生兴奋的部位对静止部位来说呈负电，冲动通过后该处电位又恢复到静息水平。因之兴奋部位与邻近部位之间可出现电位差，这种电位差可用电极加以引导并可通过适当的 仪器 放大与显示，神经干兴奋过程中所发生的这种膜外电位变化称神经干动作电位。神经干动作电位与单根神经纤维中的动作电位不同，它是由许多兴奋阈值、传导速度和幅度不同的神经纤维产生的动作电位综和而成的复合性电位变化，称为复合动作电位，其电位幅度在一定范围内可随刺激强度的变化而变化。 如果将两引导电极置于正常完整的神经干表面，当神经干一端兴奋之后，兴奋波先后通过两个引导电极，可记录到两个方向相反的电位偏转波形，称为双相动作电位。如果两个引导电极之间的神经组织有损伤，兴奋波只通过第一个引导电极，不能传导至第二个引导电极，则只能记录到一个方向的电位偏转波形，称为单相动作电位。 【实验对象】 蛙或蟾蜍 【实验器材与药品】 微机

健康 Wistar 大鼠 雌雄不限 30 日龄 体重 60-80 克 ,随机分组 每组 10 只 依据分组不同分笼饲养 可以自由进食去卵白蛋白 不含鸡蛋 的特殊纯种饲料和水 动物房温度 19-25oC 湿度 55-65% 光照 10-12 小时/天 鼠笼每周清洗消毒两次 一、致敏模型组分别于第 1 天第 8 天用新鲜配制的 OVA GradeV 1mg+ AI OH3 200mg+生理盐水 1ml 混悬液在大鼠两腹股沟 腹 前足跖 共 4 点作皮下注射每点 0.2ml 同时一点腹腔注射 0.2ml。 二、激发模型组于实验第 15 天 将大鼠置于 20cm×20cm×15cm 大小的密闭容器中由 PARI BOY高频雾化器提供雾化动力 以 1%OVA GradeII 进行雾化吸入激发 每次雾化 30min 连续 6 天。 三、 观察指标和检测方法1、外周血单个核细胞(PBMC)的制备及培养大鼠无菌心脏穿刺采血 2ml 肝素抗凝 吸取血浆 100ìl于-20o冻存待检 IgE剩余部分与等量 PBS 液充分混匀 在一试管中加入适量淋巴细胞分离液 Ficoll用滴管将血液沿管壁缓慢叠加于分离液

本文转自丁香园版主快乐桃花岛原创 主题1：将Endnote 中的文献导入文献王的数据库 方法：启动endnote的library，选择需要导出的文献，然后选择outstyle中的select another style, 然后选择Refman（RIS）export，选择这个style！（这个非常重要！） 此时，通过Endnote的菜单操作即可完成，File-export……对话框，保存为txt即可。 启动文献王，选择需要导入的目录，然后右击“导入”，选用过滤器为RIS格式，找到源文件，导入即可。 主题2：文献王导入endnote 方法：主要是选用RIS格式的滤镜将文献导出为文本文件，然后再endnote中导入，选用的FiIter为Reference Manager (RIS), 然后导入刚才从文献王中导出的那个txt文件即可。详见附图说明。 下一步：结果显示窗口 下一步：导入的选择！ 深夜发帖，目的：

摘要： 学习克隆工作中最常用的双酶切,将外源基因与质粒连接方法及操作技术. 一、实验目的： 1、学习克隆工作中最常用的双酶切； 2、学习将外源基因与质粒连接方法及操作技术； 3、学习氯化钙法制备 大肠杆菌 感受态细胞的技术； 4、了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义. 5、外源质粒 DNA 转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术. 6、学习鉴定重组子的方法. 二、实验原理： 重组子的建立：采用双酶切 质粒 载体pBR322和pUC18,酶切后产生了互补的粘性末端,在T4 DNA 连接酶的作用下,两个质粒片段连接. 感受态细胞(Competent cells)：受体细胞经过一些特殊方法(如：CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后, 细胞膜 的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) . 转化(tran

体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）1、大鼠肝细胞的分离和培养大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105　U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液。分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞。将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。2、CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立　肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16　mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度

一、实验目的 1 明确提取液的配制原理 2 通过对提取液的配制，掌握提取液中各 试剂 在提取中的作用。二、实验原理 DNA 是遗传物质, 植物DNA 的提取是植物基因工程的基础。通常要求所提取的DNA 要有理想的纯度,足够完整,无断裂降解,提取过程尽量少使用有毒化学品等。为了达到上述要求,已报道了不少提取植物DNA 的方法,归纳起来,主要有CTAB 法、SDS法和碱提取法。DNA分子是分子生物学研究的基本材料, 依不同的实验目的可采取不同的抽提方法获取数量和质量不等的DNA。因此提取液里 试剂 的配比也有所不同：植物DNA的抽提常采用CTAB方法： 配方如下： 1 配制提取液之前，先配制母液。 母液（灭菌）：5M NaCl ( 58.4g加ddH 2 O制成200ml溶液) 0.5M Na 2 -EDTA(37.22g+ddH 2 O至200ml,用NaOH调pH值为8.0) 1M Tris-HCl(12.11gTris-HCl+

世界上已报道了多种生产转基因动物的方法，主要有4类：①融合法，包括精子融合法，微细胞介导融合等。②化学法，包括DNA―磷酸钙沉淀法、DEAE―葡聚糖法、染色体介导法等。③物理法，包括显微注射法、电脉冲法、细胞冻存法等。④病毒感染法，包括重组DNA病毒感染、重组RNA病毒感染等。但真正成熟并可以稳定生产转基因动物的方法只有三种，即核显微注射DNA法、精子介导法和核移植法等基因转移方法。(1)核显微注射法 核显微注射法是动物转基因技术中最常用的方法。它是在显微镜下将外源基因注射到受精卵细胞的原核内，注射的外源基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，最后移植到受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的DNA片段。-这种方法的缺点是效率低、位置效应(外源基因插入位点随机性)造成的表达结果的不确定性、动物利用率低等，在反刍动物还存在着繁殖周期长，有较强的时间限制、需要大量的供体和受体动物等特点。(2)精子介导的基因转移 精子介导的基因转移是把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力。然后，用携带有外源基因的精子给发情母畜授精。在母畜所生的后代中，就有一定比例的动

标本需经固定后方可染色，Carnoy固定液可按无水乙醇：三氯甲烷：冰醋酸为6：3：1比例配制。固定后石蜡切片即可。尽量不用新鲜组织恒冷箱切片，因胞质中存在的缩醛磷脂会出现非特异染色。若必须使用恒冷箱切片，需做切片后固定。用已固定的组织石蜡切片可消除缩醛磷脂。减少非特异染色，具体操作如下： 1．切片脱蜡入水； 2．用lmol/L HCl浸洗； 3．切片放人预热到60℃1mol/LHCi内6分钟，(固定的标本为10～15分钟．Susa固定的标本为18分钟，水解时间因固定液不同而有差异)； 4．入室温lmol/LHCl洗； 5．蒸馏水洗； 6．人Schiff液，于室温暗处(或外包黑纸)30～60分钟； 7．人亚硫酸钠水溶液漂洗3次，每次1～2分钟； 亚硫酸钠水溶液配法： 10%NaHS03 5ml 1mol/L HCl 5ml 加蒸馏水至 100ml 8．蒸馏水洗； 9．脱水、透明、封固。 结果：细胞核内DNA染成紫红色 对照实验： 虽然Feulgen法是DNA 的特异染色方法，但如果延长水解时间并在室温下进行反应， Schiff试剂也与