FFPE 样本前处理过程及注意事项

患者活检或手术标本的研究对于阐明疾病尤其肿瘤的发病机制、指导治疗方案来说非常重要。但是活体组织一旦离体，血氧供应停止，就会产生一系列生物化学和组织形态学的改变，直至发生自溶，干缩，腐败，核酸和蛋白也会迅速降解，因此需要及时固定。福尔马林固定、石蜡包埋 (Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded, FFPE) 技术能够在组织离体后最大程度地保存其原有的形态学结构及生物学信息，成为肿瘤研究领域中疾病诊断和科学研究中非常常见的生物学材料。

在分子病理学高速发展的今天，研究人员能够从FFPE样本中获取更多有用的信息，挖掘其潜在的临床价值。然而一些大型临床项目的时间跨度有时会长达5—6年甚至更久，FFPE样本就成为很好的生物信息存储载体，为了能够充分挖掘FFPE样本中的生物学信息，我们不仅需要关注核酸提取的步骤，福尔马林固定及石蜡包埋等标本前处理过程更加不容忽视。标本前期处理的规范化、标准化流程是后期各项检测关键的第一步，也是首要环节，是后期各项技术的保证。下面为您分享标本前处理的注意事项。

标本的前处理过程包括：

 

标本固定

标本固定是组织处理最重要的一步，也是最无法补救的一步。通常选用 10% 中性缓冲福尔马林 (ph 值 7.2-7.4) 进行固定，避免酸性或无缓冲福尔马林对核酸的降解。由于手术或活检组织很可能在手术过程中就已出现血氧供应不足，因此组织需要在离体后 30 min内尽快固定。

组织标本需要充分且适度的固定，固定不足导致深处组织未接触到福尔马林而出现核酸和蛋白质降解，过度固定又会导致组织内交联严重加大核酸提取难度。组织标本厚度、福尔马林溶液的体积、固定时间是影响固定程度的三个重要因素。

福尔马林大约以 2-3 mm/24 h 的速度穿透实体组织，且渗透速度随组织厚度的增加而降低，因此当标本厚度较大时需要剖开固定，剖开的厚度以 3-5 mm 为佳。QIAGEN 发现，当固定时的组织厚度是 4 mm 时，RNA 降解程度远低于 1 cm 时。

与整个器官 (Whole organ) 进行固定相比，以 4 mm 的厚度切开后固定 (Cut organ)，RNA 的完整性更好。

为使组织被完全固定，组织与福尔马林的比例不低于 1:10, 并需要严格控制固定的时间，小标本的固定时间一般不超过 6 h，大标本组织的固定时间不超过 24 h。一项对比固定时间的实验表明 72 h固定对 RNA 完整性的影响不大，但可能交联严重影响大片段的扩增。

与 RNAlater 及 20 h 固定相比，72 h 固定后，较大片段（红色）扩增失败概率更大

 

取材

取材是标本处理的第一步，由于下一步操作使用脱水机的程序是一定的，因此规范取材是获得优良切片的前提，取材不规范，厚薄不均，往往会造成组织固定、脱水、透明、浸蜡不佳。

组织块大小以 1.5 cm x 2.0 cm x 0.2-0.3 cm 为宜，组织的大小与厚薄不要把一次性包埋盒的空间全部占满，包埋盒的四周与上下都应该留有余地，利于组织固定和脱水。

脱水

脱水指的是利用脱水剂如不同浓度的乙醇将组织内的水分逐步置换出来，需要注意彻底脱水，避免残留水分导致核酸降解。该步骤通常由脱水机完成，需要注意及时更换脱水机中的液体，使用新鲜的、高质量、不经水稀释的试剂，避免水分残留。

 

透明和浸蜡

当组织内的水分被脱水剂置换出，透明剂（通常是二甲苯）进入组织，置换出脱水剂，因透明剂的折光系数接近蛋白的折光系数，因此会使组织变得透亮，该过程称之为透明。组织透明后在熔化的石蜡内浸泡的过程称为浸蜡，该步骤建议，在不出现储藏时石蜡融化的前提下，使用溶解度低的石蜡，避免在浸蜡过程中温度升高导致核酸和蛋白降解。

 

FFPE 样本储存

包埋完成后就算大功告成啦，接下来便是存放的问题，QIAGEN 比较了在不同温度下储存的样本，发现相较于室温或更高温度，将 FFPE 样本保存在 4℃，1 年后 RNA 的完整性更高。

与常温及 37℃ 的储存条件相比，4℃ 储存的 FFPE 样本一年后 RNA 完整性更高

 

参考文献：

Ahlfen, et al. Determinants of RNA quality from FFPE samples. PLoS One, 2007.